小鼠胚胎心內(nèi)膜細(xì)胞中Calcineurin-NFATcl信號(hào)通路的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　 探討在小鼠胚胎心內(nèi)膜細(xì)胞中Calcineurin/NFATcl信號(hào)通路對(duì)FGFRl表達(dá)和胚胎心內(nèi)膜細(xì)胞增殖的影響。
　　 方法:
　　 (1)取E11.5的小鼠胚胎,免疫組化方法檢測(cè)NFATcl的陽(yáng)性表達(dá)。分離并原代培養(yǎng)小鼠胚胎E11.5心內(nèi)膜細(xì)胞(ECC)。分離的胚胎心內(nèi)膜細(xì)胞(ECC)加入M199培養(yǎng)液,并加入20%胎牛血清(FBS),37℃?zhèn)鞔囵B(yǎng),倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況。進(jìn)行ECC

2、細(xì)胞爬片,應(yīng)用免疫熒光染色法鑒定。固定的ECC經(jīng)PBS洗滌后,在含0.2%TritonX-100中通透10min。5%牛血清白蛋白室溫封閉30min后,與一抗在4℃孵育過夜。一抗為ANTI-NFATcl。二抗為異硫氰酸熒光素標(biāo)記抗體。
　　 (2)應(yīng)用CSA抑制或應(yīng)用PMA+Ionomycin激活ECC細(xì)胞Calcineurin/NFATcl信號(hào)通路后來研究對(duì)FGFRl表達(dá)的影響。提取總RNA,以GAPDH為內(nèi)參,進(jìn)行RT-PC

3、R反應(yīng),通過光密度掃描進(jìn)行半定量分析。傳代培養(yǎng)小鼠胚胎心內(nèi)膜細(xì)胞,給予不同劑量的PMA+Ionomycin、CSA作用細(xì)胞不同時(shí)間(1、2、3、4d),CCK-8法檢測(cè)不同濃度藥物對(duì)小鼠胚胎心內(nèi)膜細(xì)胞增殖的影響。
　　 (3)通過PCR擴(kuò)增FGFRl目的片段,雙酶切純化PCR產(chǎn)物及pcDNA3.1a,將擴(kuò)增的FGFRl基因片段插入pcDNA3.1a線性質(zhì)粒,即構(gòu)建成pcDNA3.1a-FGFRl真核表達(dá)質(zhì)粒,將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞

4、DH5a,篩選陽(yáng)性克隆行雙酶切鑒定及測(cè)序鑒定。
　　 結(jié)果:
　　 (1)NFATcl通過免疫組化法在胚胎心內(nèi)膜呈現(xiàn)定位清晰的淡黃色至棕褐色顆粒狀著色。凍存細(xì)胞復(fù)蘇后,增殖能力強(qiáng),和傳代細(xì)胞具有相似的生長(zhǎng)特性。ECC細(xì)胞通過免疫熒光染色法顯綠色熒光。
　　 (2)應(yīng)用CSA抑制ECC細(xì)胞中Calcineurin/NFATcl信號(hào)通路后FGFRl的表達(dá)下調(diào);應(yīng)用PMA+Ionomycin激活ECC細(xì)胞中Calcin

5、eurin/NFATcl信號(hào)通路后FGFRl的表達(dá)上調(diào)。CSA可顯著抑制小鼠胚胎心內(nèi)膜細(xì)胞的增殖,PMA+Ionomycin可顯著促進(jìn)小鼠胚胎心內(nèi)膜細(xì)胞的增殖,并且在藥物濃度和時(shí)間上呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性關(guān)系。
　　 (3)酶切及測(cè)序結(jié)果表明pcDNA3.1a-FGFRl真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　 結(jié)論:
　　 (1)NFATcl在胚胎心內(nèi)膜陽(yáng)性表達(dá)。小鼠胚胎心內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)成功。本實(shí)驗(yàn)通過培養(yǎng)小鼠胚胎心內(nèi)膜細(xì)