丹參對自殺基因旁觀者效應(yīng)的增效作用及機(jī)制研究.pdf

1、基因治療就是將外源基因?qū)氲秸；虿∽兗?xì)胞中，利用其轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物發(fā)揮治療作用的一種方法，是分子生物學(xué)技術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)中的一項(xiàng)重要應(yīng)用。近年來基因治療技術(shù)發(fā)展迅速，有希望成為腫瘤的有效治療方法。但由于目前基因治療研究中目的基因的表達(dá)水平很低，而且還缺乏調(diào)節(jié)目的的基因表達(dá)組織的特異性、表達(dá)時(shí)序性的有效手段，己成為影響基因治療效果的嚴(yán)重障礙。在這種情況下，引入“自殺基因”，設(shè)計(jì)病變細(xì)胞的自殺機(jī)制，對于抗腫瘤具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。 目

2、前應(yīng)用最多的是HSV-tk基因，將HSV-tk基因?qū)肽[瘤細(xì)胞，配合以GCV治療，使該基因的表達(dá)產(chǎn)物將GCV轉(zhuǎn)化為GCV-TP，進(jìn)而殺傷腫瘤細(xì)胞，而正常細(xì)胞則不被傷害。該療法的作用不僅僅引起被導(dǎo)入“自殺基因”的細(xì)胞死亡，而且可以通過“旁觀者”效應(yīng)(bystandereffect)殺傷未導(dǎo)入基因的鄰近分裂細(xì)胞，顯著擴(kuò)大其殺傷效應(yīng)，這對惡性腫瘤的治療顯得尤為重要。 縫隙連接(GJ)是介導(dǎo)HSV-tk基因治療“旁殺傷效應(yīng)”的重要途徑。

3、GJ除一些終末分化細(xì)胞如骨胳肌細(xì)胞，紅細(xì)胞和循環(huán)淋巴細(xì)胞外幾乎在所有動(dòng)物中存在。GJ含有通道，它們位于兩細(xì)胞之間，可非選擇性通過小分子物質(zhì)，但不允許蛋白和核酸大分子通過。GCV的代謝產(chǎn)物通過細(xì)胞間的直接接觸進(jìn)人tk-細(xì)胞，而GCV的磷酸化產(chǎn)物不能自由通過細(xì)胞膜，故推測細(xì)胞間的縫隙連接是GCV的磷酸產(chǎn)物的通道。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)也證明了縫隙連接在腫瘤局部旁觀者效應(yīng)中的作用. 目的：本實(shí)驗(yàn)旨在以往研究的基礎(chǔ)上，將tk基因?qū)際22細(xì)胞，應(yīng)

4、用HSV-tk/GCV系統(tǒng)進(jìn)行小鼠肝癌自殺基因治療的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，并聯(lián)合運(yùn)用丹參注射液，觀察聯(lián)合治療的療效，并運(yùn)用病理學(xué)技術(shù)及免疫組化等技術(shù)初步探討其機(jī)制，另外對大鼠的含藥(丹參注射液)血清和丹參注射液直接作用的H22細(xì)胞的CX-43的檢測，進(jìn)一步探討其機(jī)制，為建立中西醫(yī)結(jié)合腫瘤基因治療方案提供必要條件。 方法：在已建立能穩(wěn)定產(chǎn)病毒的PT67/tk細(xì)胞株的基礎(chǔ)上，用NIH3T3測定病毒滴度。將此病毒感染小鼠肝癌細(xì)胞株H22，G418

5、篩選出抗性克隆命名為H22/tk。并將H22細(xì)胞與H22/tk細(xì)胞以4：1的比例接種Balb/c小鼠，建立移植瘤模型進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用前藥GCV及腹腔注射丹參注射液，16日后處死測腫瘤質(zhì)量，通過病理切片觀察組織的病理變化，應(yīng)用免疫組化技術(shù)觀察腫瘤細(xì)胞CX-43的表達(dá)，應(yīng)用細(xì)胞化學(xué)法和流式細(xì)胞術(shù)體外檢測藥物作用過的H22細(xì)胞的CX-43含量的表達(dá)。 結(jié)論：體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，自殺基因系統(tǒng)聯(lián)合丹參注射液顯示出明顯的協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)；丹參注射液