全反式維甲酸聯(lián)合TK基因?qū)侨饬雠杂^者效應的研究.pdf

1、研究背景：
　　骨肉瘤是青少年最常見的原發(fā)惡性骨腫瘤之一，其惡性程度較高，發(fā)現(xiàn)時常已有微小肺轉(zhuǎn)移，預后普遍較差，而且缺乏有效的治療手段。而骨肉瘤的基因治療是最有希望的治療方法之一，在綜合治療中也是極其重要的部分。
　　其中，自殺基因（suicidegene）/前藥(prodrug)系統(tǒng)受到廣泛的重視，單純皰疹病毒-胸苷激酶(HSV-tk)/丙氧鳥苷(GCV)系統(tǒng)是目前研究最多的用來評價自殺基因的治療效果。但是操作復雜，有危險

2、性，故選擇經(jīng)濟、相對安全的Lipofectamine2000脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)染方法，將重組質(zhì)粒pIRES-EGFP-tk成功導入人骨肉瘤U-2細胞中。在自殺基因系統(tǒng)的旁觀者效應（Bystandereffect）更是引起腫瘤消退的重要因素，該系統(tǒng)的治療機制是通過基因轉(zhuǎn)移載體將自殺基因?qū)肽[瘤細胞中，自殺基因表達蛋白，在這種蛋白作用下，在腫瘤組織局部激活本身無毒或低毒的前藥(prodrug)，將其轉(zhuǎn)化為具有高度毒性的代謝產(chǎn)物，從而將腫瘤細胞殺

3、滅。旁觀者效應的物質(zhì)基礎是細胞縫隙連接（GJ），GJ由六個表達在細胞表面的同亞型連接蛋白（Cx）構成的。同類細胞間的GJ傳導能量或信息作用最強，由它介導的細胞間通訊(GJIC)可以決定細胞的正常分化和生長。Cx表達低下或位于胞漿內(nèi)時，功能性GJ就不能形成。當GJIC功能低下時，提示細胞惡性生長、增殖或異常分化。骨肉瘤細胞中的Cx43蛋白的濃度與腫瘤細胞的分化程度成正相關，提示Cx43能影響骨肉瘤細胞的發(fā)展。
　　因此，我們可以以C

4、x43蛋白的變化來觀察plRES-EGFP-TK/GCV系統(tǒng)的旁觀者效應，plRES-EGFP-TK/GCV系統(tǒng)抗腫瘤效果不明顯，或?qū)δ承┠[瘤細胞無效的原因可能TK基因轉(zhuǎn)染效率低或旁觀者效應低。旁觀者效應可以通過基因轉(zhuǎn)染Cx基因或化學輔助方法來提高。據(jù)目前研究Cx基因轉(zhuǎn)染效率不是很高，所以誘導Cx表達的化學誘導劑則應用更廣泛。這些誘導劑一般對機體無毒或毒性極低，包括維甲酸、cAMP、類胡蘿卜素、糖皮質(zhì)激素等，在誘導Cx表達時存在細胞組織

5、特異性和Cx類型特異性。
　　全反式維甲酸作為一種良好的誘導劑和分化劑，與常規(guī)化療藥相比，副作用低，不良反應較少，還能明顯的降低腫瘤的惡性程度。本實驗我們以人骨肉瘤U-2細胞株為研究對象，全反式維甲酸作用后，觀察人骨肉瘤U-2細胞膜上Cx43蛋白含量的變化，從而觀察全反式維甲酸能否增強plRES-EGFP-TK/GCV系統(tǒng)對人骨肉瘤U-2細胞的殺傷力和旁觀者效應。
　　目的：
　　觀察全反式維甲酸聯(lián)合脂質(zhì)體介導的TK/

6、丙氧鳥苷（GCV）系統(tǒng)對人骨肉瘤U-2細胞旁觀者效應的影響。
　　方法：
　　訂購重組質(zhì)粒plRES-EGFP-TK,培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染人骨肉瘤U-2細胞株,熒光倒置顯微鏡和流式細胞儀觀察轉(zhuǎn)染后細胞生長狀態(tài),四甲基偶氮哇藍（MTT）法檢測plRES-EGFP-TK/GCV系統(tǒng)對人骨肉瘤U-2細胞的生長抑制率,以及聯(lián)合ATRA與否是否增強其旁觀者效應,ELISE檢測細胞培養(yǎng)液中連接蛋白（CX）43的表達情況。
　　結(jié)果：

7、　　ATRA可以抑制U-2細胞生長,當終濃度為10-6mol/l時,明顯降低細胞存活率，形態(tài)學上主要以細胞凋亡形式出現(xiàn);當終濃度為10-7mol/l時，無抑制細胞生長作用。ATRA抑制U-2細胞生長呈濃度一時間依賴性(p<0.05)。plRES-EGFP-TK/GCV系統(tǒng)對人骨肉瘤U-2細胞旁觀者效應在TK+：TK—細胞混合比例為5:5時明顯出現(xiàn)（p＜0.05），而聯(lián)合ATRA后，在TK+:TK—細胞混合比例為3:7時就明顯出現(xiàn)（p＜0