中藥活性成分對自殺基因旁觀者效應增效作用及機制研究.pdf

1、廣州中醫(yī)藥大學博士學位論文中藥活性成分對自殺基因旁觀者效應增效作用及機制研究姓名：譚宇蕙申請學位級別：博士專業(yè)：中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)指導教師：李杰芬20050501廣州中醫(yī)藥大學21)05屆博卜學位論文CBRIl79[9／tk，擴大培養(yǎng)。②點雜交驗證：提取CBRtl7919(tk’)、CBR[[7919／tk(tk)細胞的DNA，把lSVtk基因片段用Dig標記為探針后，與C3RH7919tk、tk細胞的DNA進行點雜交，以檢測tk細胞的DN

2、A是否整合有HSVl一tk基因。③GCV對CBRH79J9、CBRH7919／tk細胞的體外殺傷作用：用01、1、10、50、100mg／L等不同濃度的GCV體外分別作異!I于tk、tk細胞，MT’r檢測存活率。2tk、tk’細胞的不同混合比例對tk／GCV系統(tǒng)旁觀者效應的影響：用GCV體外分別作用于含不同比例tk細胞的tk、tk—混合細胞，MTT檢測存活率，比較分析各組旁觀者效應大小，確定合適的tk比例。3中藥活性成分對自殺基因旁觀者

3、效應影響的體外篩選：丹參、吳萊萸堿、苦參堿、三七總皂甙等中藥單體或混合成分，以不同濃度與GCV分別或共同作用于大鼠肝癌CBRH7919或小鼠肝癌H22的tk一細胞，以及含5％或10％tk細胞的tk、tk混合細胞，MTT檢測各組存活率，兩兩比較分析各組存活率的差異和旁觀者效應大小。4對有效中藥成分誘導癌細胞凋亡的機制研究：分別用不同濃度的有效中藥成分作用于大鼠肝癌CBRH7919或小鼠肝癌1t22的tk一細胞，用流式細胞技術(shù)檢測凋亡峰、凋

4、亡指數(shù)，分析中藥成分對癌細胞周期的影響。5丹參注射液和枸杞多糖聯(lián)合自殺基因系統(tǒng)對小鼠肝癌細胞移植瘤的治療觀察：①實驗分為模型對照組、單純丹參注射液治療組、單純自殺基因系統(tǒng)tk／GCV治療組、自殺基因系統(tǒng)聯(lián)合丹參注射液治療組；把tk、tk一細胞按l：4比例混合接種Balb／c純系小鼠腋下皮下組織內(nèi)，每只小鼠接種210。個腫瘤細胞，次日隨機分組；第2天開始用中藥治療15天，長出腫瘤后用自殺基因系統(tǒng)治療10一11天，進行療效觀察。②同①方法接

5、種昆明小鼠，拘杞多糖聯(lián)合自殺基因系統(tǒng)對小鼠肝癌細胞移植瘤進行治療以及療效觀測。結(jié)果I腫瘤自殺基因HSVl一tk／GCV系統(tǒng)的構(gòu)建：①用前期工作己構(gòu)建好的包裝細胞PT67／tk分泌的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒活性顆粒感染大鼠肝癌CBRH7919(tk‘)細胞，用G418篩選獲到高耐藥性的CBRH7919／tk(tk)重組細胞。②HSVtk基因片段用Dig標記為探針后進行點雜交，檢測到tk細胞DNA上確實已整合有HSVl—tk基因，而tk細胞DNA不含

6、HSVltk基因。③GCV體外殺傷實驗發(fā)現(xiàn)GCV對tk細胞生長抑制和細胞毒作用明顯，而且有濃度、時間依賴性，而tk一細胞對GCV不敏感，表明HSVltk基因已在tk癌細胞中表達，而且表達產(chǎn)物具有較高生物活性。結(jié)果表明已成功構(gòu)建針對大鼠肝癌細胞的腫瘤自殺基因HSVl一Lk／GCV系統(tǒng)。2tk、tk一細胞不同混合比例對Lk／GCV系統(tǒng)旁觀者效應的影響：GcV對含5％和lO％tk’的混合細胞殺傷率分別為60％、252％，結(jié)果表明在CBRH79