放線菌素D誘導V79細胞旁觀者效應(yīng)及其機制和旁觀者因子篩選的實驗研究.pdf

1、前言：旁觀者效應(yīng)的發(fā)現(xiàn)由來已久，但研究幾乎都集中在α粒子、中子、γ射線、X射線等高能量的電離輻射所誘導的旁觀者效應(yīng)(bystander effect，BE)上，對于非電離輻射的其他理化因素所誘導的BE報道較少。2002年，Xiao等首次報道UVA可誘發(fā)旁觀者效應(yīng)；而且UVA照射后，瀕死細胞的無細胞培養(yǎng)液(conditionmedium，CM)也能誘導旁觀者效應(yīng)。該結(jié)果提示除電離輻射外，非電離輻射等其他理化因素也有引起B(yǎng)E的能力。由于BE

2、是原有損害效應(yīng)的延續(xù)與放大，其毒理學意義受到人們的廣泛關(guān)注。
　　 而化學因素引起靶細胞的DNA損傷誘導旁觀者效應(yīng)的相關(guān)研究很少。直到近幾年才有三篇關(guān)于烷化劑的研究，發(fā)現(xiàn)化學物質(zhì)也可能誘導旁觀者效應(yīng)。但其他化學毒物(遺傳物質(zhì)損傷劑等)是否能引起旁觀者效應(yīng)及其特征尤其是發(fā)生機制的研究幾乎還是一片空白。旁觀者效應(yīng)的發(fā)生機制尚不十分清楚，經(jīng)由不同途徑死亡的靶細胞所產(chǎn)生和釋放的旁觀者因子的性質(zhì)更沒有確定。
　　 本課題主要就化學

3、物角度，首次采用經(jīng)典的致凋亡物質(zhì)放線菌素D(Actino-mycin，ActD)來制作靶細胞DNA損傷凋亡模型，來研究旁觀者效應(yīng)情況及其發(fā)生機制，并對旁觀者因子進行篩選。
　　 1、用不同劑量ActD處理V79細胞不同時間，觀察各指標變化，確定最適的條件來建立靶細胞凋亡模型，為后續(xù)研究靶細胞在凋亡過程中能否產(chǎn)生和釋放引起旁觀者效應(yīng)的因子以及效應(yīng)因子的性質(zhì)提供實驗基礎(chǔ)資料。
　　 2、利用ActD所致V79細胞凋亡模型，取

4、不同時段靶細胞去細胞培養(yǎng)液CM，培養(yǎng)旁觀者細胞，以存活率、死亡方式、染色體畸變、超微結(jié)構(gòu)改變?yōu)闄z測終點，確定凋亡進程中CM是否能夠誘導旁觀者效應(yīng)及效應(yīng)最強時段，為闡明DNA損傷類型(凋亡)與旁觀者效應(yīng)之間的關(guān)系提供重要線索，為篩選旁觀者因子打下基礎(chǔ)。
　　 3、采用CM培養(yǎng)旁觀者細胞，觀察不同時段CM對DNA損傷反應(yīng)和凋亡關(guān)鍵基因p53，Bax，Bcl-2的表達水平。同時檢測ROS水平、細胞周期及線粒體膜電位(△Ψm)變化，推測

5、線粒體通路在導致旁觀者細胞凋亡中的作用及其他可能通路的情況。為研究化學因素誘導旁觀者細胞凋亡機制提供實驗依據(jù)與資料。
　　 4、將旁觀者效應(yīng)最強的4h時段CM與對照組CM進行2D電泳，應(yīng)用MALDI-TOF MS進行一級和二級質(zhì)譜分析，以篩選和鑒定可能存在的旁觀者因子。為確證旁觀者效應(yīng)發(fā)生的確切機制提供重要資料和線索。
　　 方法：
　　 1、ActD所致V79靶細胞凋亡模型的建立
　　 (1)細胞及培養(yǎng)

6、中國倉鼠成纖維細胞V79-C3細胞株(購自北京中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所細胞中心)。細胞株于含10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，隔天傳代。
　　 (2)細胞長至對數(shù)生長期，加入不同劑量ActD(0，0.25，0.5，1.0，2.0，4.0，8.0mg/L)處理細胞(0.5，1，2，4h)。用PBS洗3次，加正常培養(yǎng)液培養(yǎng)24h：
　　 MTT法酶標儀上測細胞存活率；
　　 A

7、nnexin V-FITC/PI雙染，流式細胞儀檢測細胞凋亡/壞死率；
　　 相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)學；
　　 染色體畸變分析檢測靶細胞染色體損傷；
　　 Hoechst33258染色；Annexin V-FITC/PI雙染，熒光顯微鏡下觀察凋亡情況；
　　 透射電子顯微鏡觀察靶細胞超微結(jié)構(gòu)的改變。
　　 2、ActD處理V79細胞后CM誘導旁觀者效應(yīng)的實驗研究
　　 (1)不同時段去靶細

8、胞培養(yǎng)液(CM)的獲取以4mg/LActD處理1h作為計時的起點，分別在第4h、8h、12h和24h取細胞培養(yǎng)液0.22μm濾器過濾后加入到正常的V79-C3細胞(旁觀者細胞)中，再培養(yǎng)24h后，進行旁觀者效應(yīng)的觀察。
　　 (2)細胞在培養(yǎng)瓶中長到75%融合時分別加入不同時段(4h、8h、12h、24h)去細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，觀察指標與靶細胞相似：
　　 相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)學并拍照。
　　 MTT法測定細

9、胞存活率。
　　 常規(guī)的染色體畸變分析方法制片，在普通光學顯微鏡下觀察染色體損傷。
　　 AnnexinV-FITC/PI雙染法流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。
　　 透射電鏡下觀察細胞超微結(jié)構(gòu)的改變。
　　 3、ActD所致V79細胞旁觀者效應(yīng)機制的研究
　　 (1)RT-PCR方法檢測p53、Bcl-2、Bax mRNA水平將對數(shù)期生長的正常細胞加入不同時段(4h、8h、12h、24h)CM培養(yǎng)2

10、4h，加入設(shè)計的各引物，RT-PCR方法檢測p53、Bcl-2、Bax mRNA水平。
　　 (2)蛋白測定將處理后的細胞爬片丙酮固定，參照SABC試劑盒免疫組織化學染色法檢測旁觀者細胞p53蛋白表達；對數(shù)期生長的正常細胞加入不同時段(4h、8h、12h、24h)CM培養(yǎng)24h，Western blotting法檢測細胞Bcl-2、Bax蛋白質(zhì)表達水平。
　　 (3)細胞周期測定方法對數(shù)期生長的正常細胞加入不同時段(4h

11、、8h、12h、24h)CM培養(yǎng)24h，PI染色，流式細胞儀檢測。計算G0/G1期，S期和G2/M期細胞數(shù)。
　　 (4)流式細胞儀測定旁觀者細胞ROS和線粒體膜電位(△Ψm)對數(shù)期生長的正常細胞加入不同時段(4h、8h、12h、24h)CM培養(yǎng)24h，2’，7’-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉(DCFH-DA)熒光染色檢測ROS活力；Rh123(Rhodamine123)熒光染色檢測線粒體膜電位(△Ψm)。
　　 (5)細胞色

12、素C含量測定采用改良的張均田法測定。細胞處理結(jié)束后，分別收集線粒體和胞質(zhì)。取待測樣品，加少許連二亞硫酸鈉，520nm比色。
　　 4、旁觀者因子的篩選
　　 (1)樣品的制備樣品超濾濃縮，沉淀室溫干燥，加入裂解液，Bradford法測蛋白濃度，-80℃保存。
　　 (2)2D電泳、染色、差異蛋白點比對第一向等電點聚焦，第二向SDS-PAGE電泳，硝酸銀染色。凝膠用圖像掃描儀掃描，選擇正常對照組CM蛋白質(zhì)的凝膠圖像

13、作為參考膠，旁觀者效應(yīng)最強時段組CM凝膠圖像與之進行比對，比對分析采用ImageMaster2D Elite4.O1軟件。
　　 (3)差異蛋白質(zhì)的MALDI-TOF質(zhì)譜分析將銀染凝膠膠內(nèi)原位酶解，MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀進行一級二級質(zhì)譜，肽質(zhì)量指紋圖譜分析，鑒定蛋白質(zhì)。
　　 (4)肽質(zhì)量指紋圖譜的數(shù)據(jù)庫查詢將MALDI-TOF-MS肽質(zhì)量指紋圖譜分析得到的數(shù)據(jù)(肽片段質(zhì)量)搜索數(shù)據(jù)庫，從而鑒定蛋白。
　　

14、 5、數(shù)據(jù)處理
　　 使用SPSS11.5軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。計量資料用單向方差分析(ANOVA)，LSD法進行兩兩比較；計數(shù)資料用X2檢驗分析。檢驗水準α=0.05。
　　 結(jié)果：
　　 1、MTT法檢測ActD對靶細胞存活率的影響，細胞形態(tài)學的觀察，流式細胞儀分析均發(fā)現(xiàn)4.0mg/L處理1h時細胞凋亡率最高壞死率較低達到建立V79細胞凋亡模型的目的。同時，用熒光染色和透射電鏡觀察也證實了在該條件下

15、細胞的改變主要是凋亡。而且染色體畸變實驗也表明ActD是一種DNA損傷劑，可以引起V79細胞的染色體畸變。
　　 2、觀察不同時段CM所致旁觀者效應(yīng)。細胞形態(tài)、存活率及染色體分析顯示4hCM誘導旁觀者細胞損傷的作用最強。隨后逐漸減輕，24h時段又趨嚴重。凋亡率與之一致且與靶細胞一樣死亡方式主要是凋亡。電鏡觀察各CM組細胞凋亡現(xiàn)象明顯，4hCM處理組最重。各指標24h時段反彈現(xiàn)象可能是由于旁觀者因子累積效應(yīng)。
　　 3、研

16、究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CM組p53mRNA和蛋白質(zhì)表達水平均比對照組升高，與旁觀者細胞凋亡率的變化一致，提示ActD誘導的旁觀者細胞凋亡可能是p53介導的。旁觀者細胞出現(xiàn)了G1期阻滯，Bax mRNA及蛋白質(zhì)表達增加，Bcl-2mRNA及蛋白質(zhì)表達下降，線粒體膜電位(△Ψm)下降，CytC釋放增加，均說明p53通過線粒體途徑參與了旁觀者細胞的凋亡。且CM處理組ROS水平增加，提示氧化損傷途徑可能也參與了旁觀者細胞的凋亡。故我們推測p53-Bcl-

17、2、Bax-CytC-caspase3(即線粒體通路)途徑在導致ActD的CM引起旁觀者細胞凋亡中起重要的主導作用。
　　 4、用蛋白質(zhì)組學技術(shù)篩選旁觀者因子發(fā)現(xiàn)，實驗組CM與對照組存在蛋白差異點，TPXⅡ明顯降低。但尚需采用其它方法如檢測其mRNA及蛋白水平對質(zhì)譜結(jié)果進一步驗證。
　　 結(jié)論：
　　 1、ActD可以引起V79細胞染色體的損傷，是一種V79細胞的化學誘變劑。其制作凋亡模型的最適劑量和時間為：4.

18、0mg/L作用1h。
　　 2、凋亡過程中的去靶細胞培養(yǎng)液(CM)可以誘導旁觀者效應(yīng)。產(chǎn)生旁觀者效應(yīng)的最強時段為4h。旁觀者細胞的死亡方式與靶細胞一樣也以凋亡為主。24h時段反彈現(xiàn)象說明可能存在旁觀者因子累積效應(yīng)。
　　 3、p53可能通過線粒體途徑介導了旁觀者細胞的凋亡。CM處理組ROS水平增加，提示氧化損傷途徑也可能參與了旁觀者細胞的凋亡或者旁觀者效應(yīng)。
　　 4、質(zhì)譜分析顯示實驗組CM與對照組CM存在蛋白差