尾加壓素抑制單核巨噬細胞分泌基質金屬蛋白酶的研究.pdf

1、心力衰竭是一種復雜的臨床癥狀群，是各種心臟病的嚴重階段。其發(fā)病率高，5年存活率與惡性腫瘤相仿。在美國心臟病學院2003年年會開幕式上，Braunwald教授將心衰稱作為心臟病最后的大戰(zhàn)場。據(jù)國外流行病學研究統(tǒng)計，人群中心衰的患病率約為1.5％～2.0％，65歲以上人群可達6％～10％。在過去的40年中，由心衰導致的死亡增加了6倍。專家預測近期內心衰的發(fā)病率仍將繼續(xù)增長。因此，心衰正在成為21世紀最重要的心血管病癥。心衰時細胞外基質(EC

2、M)的變化可表現(xiàn)為纖維膠原的過度沉積，或不適當?shù)慕到狻＠绻Ｋ佬呐K的非梗死區(qū)、高血壓心臟病的肥厚左室和非肥厚右室均有間質纖維化?；|金屬蛋白酶(MMps)是ECM代謝的主要蛋白酶，單核/巨噬細胞是合成基質金屬蛋白酶的主要部位，后者以酶原形式分泌，被激活后可降解細胞外基質。因而基質金屬蛋白酶在心室重塑的調控中起著十分重要的作用，并影響心衰的發(fā)生、發(fā)展過程。針對心衰，盡管目前的治療措施很多，但仍有相當一部分患者對現(xiàn)有藥物治療無效，研究者不斷

3、在尋找新的發(fā)病機制和治療靶點。尾加壓素Ⅱ(UrotensinⅡ)即是近期發(fā)現(xiàn)和研究熱點之一，它是一種由十二個氨基酸組成的具有血管活性的“生長抑素樣環(huán)肽”，最早從硬骨魚尾部的神經分泌系統(tǒng)——尾部下垂體中分離出來，后來證實從軟體動物到哺乳動物的神經系統(tǒng)中均有存在。U-Ⅱ對多系統(tǒng)具有復雜的生理效應，目前研究多集中于心血管系統(tǒng)及神經內分泌系統(tǒng)。1999年Ames等首次證實人體內有Urotensin-Ⅱ的特異性受體——孤兒受體GPR14的存在，并

4、在人的心血管組織中(包括冠狀動脈硬化的斑塊)發(fā)現(xiàn)了UrotensinⅡ的存在。心肌組織、冠狀動脈粥樣硬化斑塊以及脂質沉淀的平滑肌細胞和巨噬細胞豐富的區(qū)域富含Urotensin-Ⅱ。DouglasAS等對晚期心哀患者的心肌組織尾加壓素含量及其受體含量進行測定，結果發(fā)現(xiàn)不僅心肌細胞，晚期心哀患者炎癥細胞尾加壓素含量亦有升高。UⅡ與GPR14結合后導致細胞內[Ca2+]升高，引起心功能抑制、血管收縮等一系列心血管效應，其縮血管效應比內皮素-1

5、(ET-1)強10余倍，是迄今發(fā)現(xiàn)的體內最強的縮血管活性物質之一，是目前已知的在哺乳動物體內最強的縮血管物質，并具有促進血管平滑肌細胞及心肌成纖維細胞分裂增殖的作用。上述發(fā)現(xiàn)均提示Urotensin-Ⅱ可能影響心血管的穩(wěn)態(tài)調節(jié)和病理過程，可能參與了心血管疾病病理狀態(tài)下的心室重塑過程。本研究從細胞水平出發(fā)，以單核細胞為研究對象，探討Urotensin-Ⅱ與心室重塑的關系。 目的：通過觀察尾加壓素Ⅱ對人單核巨噬細胞增殖和功能的影響，

6、闡明這一血管活性物質在心室重塑中的意義和可能發(fā)揮的作用；通過對尾加壓素與心室重塑關系的研究，為心血管疾病的防治提供理論和實踐依據(jù)。 方法：1.取健康人新鮮靜脈全血，用相對密度為1.076的Percoll應用液，分離提取單核細胞層，Hanks液清洗后在37℃條件下RPMI1640液中培養(yǎng)2小時。洗去上層淋巴液，貼壁的單核細胞用RPMI+5％CO2、30％自體血清在同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)7天。 2.分組24孔塑料培養(yǎng)板，每孔加入

7、單核巨噬細胞、濃度為2×105個/ml細胞0.5ml，隨機分組，n=6。分別加入1×10-8mmol/L、1×10-9mmol/L、1×10-10mmol/L、0mol/L尾加壓素，每組再隨機分成3小組，n=2，分別加入3H-Leu，3H-TdR，3H-UR1μCi/ml。 3.DNA、RNA及蛋白質合成測定分組加樣細胞繼續(xù)培養(yǎng)24h后去培養(yǎng)液，Hanks液清洗，用0.25％胰酶+0.04％EDTA液將細胞全部消化，移至F49濾

8、紙上，經淋洗、固定、脫水烘干后，置含0.03％POPO的二甲笨閃爍液中，在液體閃爍記數(shù)儀(Packark4000型)中測樣品放射性。 同樣加2×105個/ml細胞0.5ml于18孔塑料培養(yǎng)板中，隨機分為3組，n=6，分別加入3H-UR、3H-TdR、3H-Leu1μCi/ml，用上述方法測細胞在無尾加壓素影響培養(yǎng)時第1d、4d、7dDNA、RNA和蛋白質合成狀態(tài)。 4.細胞蛋白含量測定將細胞培養(yǎng)于8孔塑料培養(yǎng)板中，隨機分

9、組，n=2，培養(yǎng)至第3天分別加入1×10-8mmol/L、1×10-9mmol/L、1×10-10mmol/L、0mmol/L尾加壓素，繼續(xù)培養(yǎng)至第7天，收集細胞。Lowery法常規(guī)測細胞蛋白含量。 5.總RNA抽提與逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)每107個單核細胞源巨噬細胞(HMDM)用1mlTRIZOL抽提液用一步法抽提總RNA。選購MMP-2、MMP-9等寡核苷酸引物，人β-actin做內參照。應用圖像處理系統(tǒng)測定平

10、均光密度值(OPTDM)。 6.目的蛋白表達檢測采用WesternBlot方法。首先SDS-PAGE電泳分離樣品蛋白質，轉移緩沖液電泳200mA、100V電泳6h轉膜，記錄標準蛋白的位置，洗膜，封閉液封閉，漂洗，加含二抗的印記緩沖液雜交，再漂洗，發(fā)光底物緩沖液沖洗，顯色液顯色，暗房中感光，拍照并行灰度掃描測定。 7.MMPs活性測定采用Zymography方法。SDS-PAGE電泳，在配制12％分離膠過程中，加入一定量白

11、明膠使其濃度為1g/L。細胞上清液與載樣緩沖液以3：1比例混合后，取20μl不經煮沸直接加在4％濃縮膠的加樣孔內，4℃、200mA、200V電壓下電泳。電泳后將膠洗滌，孵育緩沖液內37℃孵育過夜，CoomassieBlueR-250染色，脫色液中脫色，照相，對降解帶密度、面積進行掃描測定，干膠保留。每次電泳均同時加同一對照細胞上清液標本作為內參照，以降解條帶密度面積的乘積表示MMPs活性。 結果：1.在RPMI1640+5％CO

12、2、30％自體血清中，細胞生長、成熟、分裂狀態(tài)良好，細胞合成DNA、RNA、蛋白迅速，尤以3H-UR摻入作用較強。 成熟的人單核巨噬細胞與1×10-8mmol/L、1×10-9mmol/L、1×10-10mmol/L、0mmol/L濃度范圍的尾加壓素孵育24h，未見細胞有形態(tài)學改變。1×10-10mmol/L尾加壓素即對3H-UR，3H-TdR摻入有抑制作用(p＜0.01，p＜0.05)。隨濃度升高，對兩者作用均加強，且在1×1

13、0-9mmol/L、1×10-8mmol/L濃度處對3H-TdR摻入抑制作用較3H-UR強，對RNA與DNA合成抑制作用兩者比較差異有顯著性。在該濃度范圍內對蛋白質合成抑制作用較弱，低濃度時(1×10-10mmol/L)無抑制作用，在1×10-8mmol/L、1×10-9mol/L濃度時有抑制作用(p＜0.05)，其作用低于DNA、RNA組，兩者比較均有顯著性(p＜0.05)。 2.細胞與尾加壓素培養(yǎng)4d后，尾加壓素組細胞透亮度

14、較高，形態(tài)不及對照組飽滿，顆粒較少，蛋白質含量差異明顯(p＜0.01)，細胞活力純度無影響，作用呈濃度依賴性。 3.UrotensinⅡ對單核細胞源巨噬細胞MMMP-2和MMP-9mRNA和蛋白表達的影響不同濃度(1×10-8、1×10-9及1×10-10mmol/L)UrotensinⅡ對HMDMMMP-2mRNA表達的影響與對照組比較有顯著性差異(平均光密度比值分別為0.85±0.05、0.86±0.06和0.89±0.04

15、vs0.99±0.05，n=4，P＜0.05)；MMP-9mRNA的表達也明顯低于對照組(平均光密度比值分別為0.84±0.05、0.85±0.04和0.88±0.04vs0.99±0.05，n=4，P＜0.05)。Westernblot蛋白印跡結果也表明，不同濃度UrotensinⅡ(1×10-8、1×10-9及1×10-10mmol/L)組HMDMMMP-2、MMP-9蛋白表達明顯低于對照組。 4.UrotensinⅡ對HM

16、DMMMP-2和MMP-9活性的影響不同濃度(1×10-8、1×10-9及1×10-10mmol/L)UrotensinⅡ對HMDM培養(yǎng)上清MMP-2活性的影響與對照組比較有顯著性差異(平均光密度比值分別為98.35±11.15、102.29±10.45和108.45±11.25vs127.93±13.61，n=4，P＜0.05)；MMP-9的活性也明顯底于對照組(平均光密度比值分別為40.01±8.96、45.38±9.32和52.1