金屬蛋白酶組織抑制因子-1對(duì)高基質(zhì)金屬蛋白酶-9大鼠模型心室重構(gòu)的影響.pdf

1、研究背景：
　　心室重構(gòu)(ventricular remodeling)是多種心血管疾病(如：高血壓病、心肌梗死、心肌病、風(fēng)濕性心臟病等)發(fā)展為慢性心功能不全的主要病理機(jī)制之一。探討心室重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，對(duì)于防治心功能不全，改善心血管病患者預(yù)后具有重要的意義。
　　心室重構(gòu)包括心肌細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellar matrix，ECM)量和質(zhì)的變化，并最終導(dǎo)致心室形態(tài)和功能的異常?；|(zhì)金屬蛋白酶(Matrix me

2、talloproteinases，MMPs)是降解細(xì)胞外基質(zhì)成分的最主要蛋白水解系統(tǒng)之一，MMPs通過(guò)直接溶解心肌中的ECM（如膠原、彈力纖維等），參與多種生理和病理過(guò)程。基質(zhì)金屬蛋白酶-9（Matrix metalloproteinases-9,MMP-9）是心肌中主要的MMPs，既往研究已顯示，一些心血管疾病心室重構(gòu)過(guò)程中存在MMP-9表達(dá)增高，同時(shí)伴有心肌ECM膠原降解增加、室壁抵抗力下降、心室擴(kuò)大、心功能異常等表現(xiàn)。金屬蛋白酶組

3、織抑制因子-1(Tissue Inhibitor Metalloproteinase-1,TIMP-1）作為 MMP-9的內(nèi)源性特異抑制因子，可與活性MMP-9以1:1比例共價(jià)結(jié)合形成不可逆復(fù)合物，阻斷MMP-9與底物結(jié)合，從而減少基質(zhì)的降解。以往的研究也顯示一些治療在改善高M(jìn)MP-9心室重構(gòu)的同時(shí)MMP-9/TIMP-1失衡也獲得明顯改善，提示MMP-9、TIMP-1平衡可能決定著心室重構(gòu)走向。然而，這些結(jié)果大多數(shù)并非來(lái)自于直接針對(duì)M

4、MP-9、TIMP-1平衡干預(yù)的研究，而是來(lái)自于疾病本身或針對(duì)疾病治療的研究。有必要通過(guò)單純MMP-9、TIMP-1失衡模型和直接調(diào)節(jié)兩者失衡的實(shí)驗(yàn)闡明MMP-9、TIMP-1以及 MMP-9/TIMP-1對(duì)心室重構(gòu)的影響及其機(jī)制。為此，本研究擬模擬一些疾病的高 MMP-9狀態(tài)，通過(guò)輸入重組大鼠 MMP-9提高體內(nèi) MMP-9水平制作高M(jìn)MP-9大鼠模型觀察其心室重構(gòu)的表現(xiàn)，并通過(guò)輸入重組大鼠 TIMP-1拮抗高M(jìn)MP-9，觀察對(duì)其心室

5、重構(gòu)的影響和機(jī)制。探討高M(jìn)MP-9心室重構(gòu)的治療方法和MMP-9/TIMP-1平衡對(duì)心室重構(gòu)的影響。為進(jìn)一步闡明心室重構(gòu)的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)，同時(shí)為心室重構(gòu)尋求新的治療途徑。
　　目的：
　　探討TIMP-1對(duì)高M(jìn)MP-9表達(dá)引起的心室重構(gòu)是否具有改善作用及其作用機(jī)制，為進(jìn)一步闡明心室重構(gòu)的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)，同時(shí)為心室重構(gòu)尋求新的治療途徑。
　　方法：
　　1.健康8周齡雄、雌性Wistar大鼠各18只，體重160

6、g～240g，按體重、性別分層隨機(jī)化分為三組：正常對(duì)照組（簡(jiǎn)稱(chēng)對(duì)照組）、高 MMP-9模型組（簡(jiǎn)稱(chēng)模型組）及TIMP-1干預(yù)組（簡(jiǎn)稱(chēng)干預(yù)組），每組各12只，共36只。各組大鼠的基線(xiàn)水平無(wú)明顯差異。以上三組分別給予生理鹽水(2ml)、rrMMP-9=(30ng)(2ml)、rrMMP-9（30ng）+rrTIMP-1（120ng)(2ml)腹腔注射每天1次，每組中的6只連續(xù)注射至第14天，結(jié)束實(shí)驗(yàn)，此為第一階段組（n=18）；各組剩余的6

7、只大鼠予繼續(xù)注射至第28天，結(jié)束實(shí)驗(yàn)，此為第二階段組（n=18）。
　　2.兩階段組的實(shí)驗(yàn)前1天、實(shí)驗(yàn)第14天以及第二階段組的第28天予無(wú)創(chuàng)尾動(dòng)脈血壓計(jì)測(cè)量血壓。第一和第二階段組分別在實(shí)驗(yàn)第15天和第29天予心臟彩超檢查左室大體結(jié)構(gòu)[左室舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）、左室收縮末期內(nèi)徑（LVIDs）、舒張末期室間隔厚度（IVSd）、舒張末期左室后壁厚度（LVPWd）、左室舒張末期容積(LVEDV)、左室收縮末期容積（LVESV）]；左

8、室功能[短軸縮短率(LVFS)、心排血量(CO)、每搏輸出量(SV)、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、二尖瓣血流 E峰與 A峰的比值(E/A)、心率(HR)]。
　　3. B超檢查后處死動(dòng)物，ELISA法檢測(cè)血清MMP-9、TIMP-1水平；分離左室以檢測(cè)左室重量指數(shù)（LVWI=左室重量mg/體重g）；HE染色（蘇木素-伊紅染色）觀察光鏡下心肌細(xì)胞及心肌間質(zhì)的變化；VG（van Gieson）染色觀察心肌間質(zhì)膠原分布，圖像分析法測(cè)定膠原

9、容積分?jǐn)?shù)（CVF）；免疫印跡法（western blotting）檢測(cè)心肌組織中MMP-9、TIMP-1水平以及Ⅰ型、Ⅲ型膠原水平；RT-PCR法檢測(cè)心肌組織中MMP-9mRNA和TIMP-1mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.模型組左室重量指數(shù)的變化及TIMP-1干預(yù)的影響
　　第一階段模型組左室重量指數(shù)顯著性高于對(duì)照組(P<0.05)，TIMP-1干預(yù)后呈進(jìn)一步增高趨勢(shì)。第二階段左室重量指數(shù)變化與第一階段相似。<

10、br>　　2.模型組左室大體結(jié)構(gòu)和功能的改變及TIMP-1干預(yù)的影響
　　1）第一階段模型組LVIDd和LVEDV相比對(duì)照組呈增大趨勢(shì)，TIMP-1干預(yù)后有所減輕，但差異未達(dá)顯著性(P>0.05).
　　2）第二階段模型組LVIDd和LVEDV顯著大于對(duì)照組(P<0.05)，TIMP-1干預(yù)組該指標(biāo)與對(duì)照組比無(wú)明顯差異(P>0.05)，提示 TIMP-1干預(yù)后左室增大情況有所改善。
　　3）其余結(jié)構(gòu)和功能指標(biāo)與對(duì)照組比

11、均未見(jiàn)明顯差異。
　　3.模型組心肌組織病理形態(tài)學(xué)的改變及TIMP-1干預(yù)的影響
　　1）形態(tài)學(xué)改變(HE染色)：第一階段模型組心肌細(xì)胞較對(duì)照組排列紊亂，心肌纖維斷裂，胞漿溶解壞死，小血管壁增厚。TIMP-1干預(yù)后心肌細(xì)胞排列較模型組整齊，心肌纖維斷裂、胞漿溶解壞死明顯改善。第二階段上述改變更為明顯。
　　2）心肌間質(zhì)膠原變化(VG染色)：第一階段模型組與對(duì)照組相比，心肌間質(zhì)膠原含量減少，TIMP-1干預(yù)后，膠原含量增

12、多。CVF值：第一階段模型組CVF值顯著性低于對(duì)照組(P<0.05)，TIMP-1干預(yù)后，CVF值明顯增高，而且高于對(duì)照組(P<0.05)。第二階段各組大鼠心肌間質(zhì)膠原含量、分布以及CVF變化情況與第一階段相似。
　　4.模型組心肌組織中MMP-9、TIMP-1水平的改變及TIMP-1干預(yù)的影響
　　1）第一階段模型組心肌組織中 MMP-9水平顯著高于對(duì)照組(P<0.001)，TIMP-1水平顯著低于對(duì)照組(P<0.001)

13、。TIMP-1干預(yù)后，MMP-9水平降低為顯著低于對(duì)照組(P<0.001)，TIMP-1水平則升高至顯著高于對(duì)照組(P<0.001)。第二階段各組大鼠心肌組織MMP-9、TIMP-1水平的改變與第一階段類(lèi)似。
　　2）第一階段模型組MMP-9/TIMP-1比值顯著高于對(duì)照組(P<0.001)，TIMP-1干預(yù)后 MMP-9/TIMP-1比值明顯下降，顯著低于對(duì)照組(P<0.001)。第二階段對(duì)照組MMP-9/TIMP-1比值與第一

14、階段相當(dāng)，模型組MMP-9/TIMP-1比值高于第一階段，TIMP-1干預(yù)后MMP-9/TIMP-1比值與第一階段相近似，提示隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，TIMP-1干預(yù)的矯治作用更明顯。
　　5.心肌組織MMP-9、TIMP-1水平與LVWI、LVIDd、CVF的相關(guān)性分析
　　1）LVWI：
　?、俚谝浑A段心肌組織MMP-9水平與LVWI無(wú)明顯相關(guān)性(r=0.377，P>0.05)；TIMP-1水平與LVWI呈正相關(guān)(r=0.

15、528,P<0.05)；MMP-9/TIMP-1比值與LVWI無(wú)明顯相關(guān)性(r=0.396,P>0.05)。
　　②第二階段心肌組織MMP-9、TIMP-1水平與LVWI的相關(guān)性與第一階段相似。即,心肌組織MMP-9水平與LVWI無(wú)明顯相關(guān)性(r=0.270，P>0.05)；TIMP-1水平與LVWI呈正相關(guān)(r=0.499,P<0.05)；MMP-9/TIMP-1比值與LVWI無(wú)明顯相關(guān)性(r=0.078,P>0.05)。

16、>　　2）LVIDd：
　?、俚谝浑A段心肌組織MMP-9水平與LVIDd呈正相關(guān)(r=0.550，P<0.05)；TIMP-1水平與LVIDd呈負(fù)相關(guān)(r=-0.496,P<0.05)；MMP-9/TIMP-1比值與LVIDd呈正相關(guān)(r=0.549,P<0.05)。
　?、诘诙A段心肌組織MMP-9、TIMP-1水平與LVIDd的相關(guān)性與第一階段相似。即，心肌組織MMP-9水平與LVIDd呈正相關(guān)(r=0.515，P<0.

17、05)；TIMP-1水平與LVIDd呈負(fù)相關(guān)(r=-0.471,P<0.05)；MMP-9/TIMP-1比值與LVIDd呈正相關(guān)(r=0.614,P<0.01)。
　　3）CVF：
　?、俚谝浑A段心肌組織 MMP-9水平與 CVF呈負(fù)相關(guān)(r=-0.632，P<0.001)；TIMP-1水平與CVF呈正相關(guān)(r=0.610，P<0.001)。MMP-9/TIMP-1比值與CVF呈負(fù)相關(guān)(r=-0.612，P<0.001)。<

18、br>　?、诘诙A段心肌組織MMP-9、TIMP-1水平與CVF的相關(guān)性與第一階段相似，但相關(guān)程度提高。即，心肌組織MMP-9水平與CVF呈負(fù)相關(guān)(r=-0.815，P<0.001)；TIMP-1水平與CVF呈正相關(guān)(r=0.779，P<0.001)；MMP-9/TIMP-1比值與CVF呈負(fù)相關(guān)(r=-0.792,P<0.001)。
　　6.模型組血清MMP-9、TIMP-1水平的改變及TIMP-1干預(yù)的影響
　　1）第一階

19、段模型組血清MMP-9水平顯著高于對(duì)照組(P<0.001)，TIMP-1干預(yù)后血清MMP-9水平有所減低，但仍高于對(duì)照組(P<0.001)；模型組血清TIMP-1水平顯著高于對(duì)照組(P<0.001)，TIMP-1干預(yù)后血清TIMP-1水平進(jìn)一步增高。
　　2）第二階段各組血清MMP-9、TIMP-1水平改變和第一階段類(lèi)似。
　　7.心肌組織MMP-9、TIMP-1水平與血清MMP-9、TIMP-1水平的相關(guān)性
　　1）

20、第一階段心肌組織 MMP-9水平與血清 MMP-9水平無(wú)明顯相關(guān)性(r=0.326,P>0.05)；心肌組織 TIMP-1水平與血清 TIMP-1水平無(wú)明顯相關(guān)性(r=0.415，P>0.05)；心肌組織MMP-9/TIMP-1比值與血清MMP-9/TIMP-1比值呈正相關(guān)(r=0.838，P<0.001)。
　　2）第二階段心肌組織和血清MMP-9、TIMP-1的相關(guān)性與第一階段相似。即，心肌組織MMP-9水平與血清MMP-9水

21、平無(wú)明顯相關(guān)性(r=0.439,P>0.05)；心肌組織TIMP-1水平與血清TIMP-1水平無(wú)明顯相關(guān)性(r=0.212,P>0.05)；心肌組織 MMP-9/TIMP-1比值與血清 MMP-9/TIMP-1比值呈正相關(guān)(r=0.929，P<0.001)。
　　8.模型組心肌組織中Ⅰ型、Ⅲ型膠原水平的改變及TIMP-1干預(yù)的影響
　　1）第一階段模型組心肌組織中Ⅰ型膠原水平顯著低于對(duì)照組(P<0.001)；TIMP-1干預(yù)

22、后Ⅰ型膠原水平有所提高，但仍顯著低于對(duì)照組(P<0.001)；第二階段模型組Ⅰ型膠原水平降低更明顯，TIMP-1干預(yù)后Ⅰ型膠原水平與第一階段相近。
　　2）第一階段模型組心肌組織中Ⅲ型膠原水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；TIMP-1干預(yù)后Ⅲ型膠原水平顯著提高并且高于對(duì)照組(P<0.01，P<0.05)。第二階段Ⅲ型膠原水平變化情況與第一階段類(lèi)似。但由于對(duì)照組心肌組織中Ⅲ型膠原水平較第一階段明顯升高，因此，TIMP-1干預(yù)組Ⅲ型

23、膠原水平反而比第一階段更接近對(duì)照組。
　　3）第一階段模型組Ⅰ型/Ⅲ型膠原比值顯著低于對(duì)照組(P<0.001)，TIMP-1干預(yù)后進(jìn)一步降低(P<0.05)。第二階段模型組Ⅰ型/Ⅲ型膠原比值仍顯著低于對(duì)照組(P<0.001)，但TIMP-1干預(yù)后卻高于模型組(P<0.05)，且由于對(duì)照組Ⅰ型/Ⅲ型膠原比值較第一階段降低，TIMP-1干預(yù)組該比值雖仍低于對(duì)照組(P<0.001)，但比第一階段更接近于對(duì)照組。
　　9.心肌組織M