腫瘤細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶活性的動態(tài)光學(xué)成像.pdf

1、基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix Metaloproteinases，MMPs)是一種可降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白水解酶，在惡性腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成過程中起著重要的作用?；|(zhì)金屬蛋白酶抑制劑作為新型抗腫瘤藥物，在腫瘤治療方面具有良好的開發(fā)與應(yīng)用潛力。建立實(shí)時(shí)在體檢測MMPs 活性的方法，對于高通量在體篩選MMPs 抑制劑具有重要的作用。1應(yīng)用基因工程技術(shù)合成用于在體檢測水解酶活性的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）探針，通過FRET 成像能

2、動態(tài)監(jiān)測在體外和不同細(xì)胞表達(dá)水解酶的活性。 本研究中應(yīng)用基因工程技術(shù)合成了兩對可用于在活細(xì)胞或活動物體內(nèi)檢測MMPs活性的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）探針，此FRET 探針設(shè)計(jì)原理為：將能發(fā)生FRET的熒光蛋白對CFP/YFP 或CFP/DsRed 用MMPs 識別的肽相連，構(gòu)建成YFP-MMPs底物識別序列-CFP 或DsRed- MMPs 底物識別序列-CFP 的融合蛋白。在體外利用純化的熒光探針對MMP 酶的活性及抑制劑的

3、作用進(jìn)行了實(shí)時(shí)動態(tài)的光譜學(xué)分析，而且此探針對MMP2 具有較高的酶切特異性。將這兩個(gè)探針用展示技術(shù)錨定在細(xì)胞膜的外表面，用于檢測分泌到細(xì)胞外的MMPs 活性。當(dāng)細(xì)胞外液無MMPs 時(shí), 此FRET 探針保持其完整性時(shí)，CFP 與YFP 或CFP 與DsRed 之間能夠發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移；當(dāng)腫瘤細(xì)胞高表達(dá)MMPs，分泌到細(xì)胞外液中的MMPs 活性較高時(shí)，F(xiàn)RET 探針被MMPs 裂解，使得熒光受體蛋白YFP 或DsRed 游離到細(xì)胞外液

4、中，而熒光供體蛋白CFP 仍保留在腫瘤細(xì)胞上。因此，無論是通過FRET 熒光成像還是單獨(dú)檢測YFP 或DsRed 熒光信號，均能靈敏地反映腫瘤細(xì)胞的MMPs 活性。 本研究中，將此FRET 探針分別轉(zhuǎn)染到MDA-MB 435s 細(xì)胞（高表達(dá)MMP s）和MCF-7 細(xì)胞（低表達(dá)MMPs），篩選穩(wěn)定表達(dá)熒光探針的細(xì)胞株，利用FRET 技術(shù)在活細(xì)胞內(nèi)實(shí)時(shí)監(jiān)測了MMPs 的活性及MMPs 抑制劑GM6001 的作用。此外，將穩(wěn)定表達(dá)F