FMR1基因敲除小鼠腦組織中SPAR的表達(dá).pdf

1、脆性X綜合征(fragileXsyndrome，F(xiàn)XS)是一種常見的遺傳性智力低下性疾病，臨床表現(xiàn)主要有不同程度的智力障礙、青春期后巨大睪丸、部分患者有特征性面容，如長臉、招風(fēng)耳、高腭弓，以及自閉癥等精神行為異常。FXS是由脆性X智障基因(fragileXmentalretardation1，F(xiàn)MR1)中5端非編碼區(qū)CGG三核苷酸重復(fù)序列不穩(wěn)定擴(kuò)增及其異常甲基化，使FMR1基因失活，導(dǎo)致其編碼的產(chǎn)物—脆性X智力低下相關(guān)蛋白(fragil

2、eXmentalretardationprotein，F(xiàn)MRP)表達(dá)的缺失或減少引起。形態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)脆性X綜合征患者和FMR1基因敲除小鼠樹突棘成熟和修剪障礙，樹突棘呈明顯瘦長、扭曲的幼稚形態(tài)，不成熟的樹突棘形成突觸的能力嚴(yán)重受損。對FMR1基因敲除小鼠的電生理研究發(fā)現(xiàn)海馬區(qū)代謝性谷氨酸受體(metabotropicglutamatereceptor，mGluR)所觸發(fā)的長時(shí)程抑制(Long-termDepression，LTD)延長，

3、長時(shí)程增強(qiáng)(Long-termPotentiation，LTP)不變。上述研究從結(jié)構(gòu)和功能兩方面都表明FMRP缺乏可導(dǎo)致突觸可塑性改變，故目前認(rèn)為其可塑性的改變是產(chǎn)生脆性X綜合征智能低下的主要機(jī)理，但是FMRP如何影響突觸可塑性至今仍不清楚。目前已知FMRP是一種mRNA結(jié)合蛋白，F(xiàn)MRP在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)之間穿梭，改變與其結(jié)合的mRNA的亞細(xì)胞定位，影響轉(zhuǎn)錄過程及翻譯后修飾，調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)，推測FMRP可能通過調(diào)節(jié)與神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能有

4、關(guān)的蛋白來影響突觸的可塑性，有研究表明在行為依賴的突觸活動中FMRP的含量增高，也提示FMRP在突觸可塑性中起重要作用。由于樹突棘的改變是脆性X綜合癥的主要病理變化，且樹突棘是構(gòu)成哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性突觸傳遞的主要部位，因而尋找受FMRP調(diào)節(jié)的mRNA，并探討其編碼蛋白在樹突棘發(fā)育及突觸可塑性中的作用，對明確FXS的發(fā)病機(jī)制可能有重大意義。 近年新發(fā)現(xiàn)的棘相關(guān)的Rap三磷酸鳥苷酶激活蛋白(Spine-associatedR

5、apGAP，SPAR)被發(fā)現(xiàn)與樹突棘形態(tài)有關(guān)。已知樹突棘主要構(gòu)成興奮性突觸后膜，而SPAR也定位于突觸后膜。樹突棘的主要成分actin在維持棘的形態(tài)中起主要作用，研究表明SPAR具有與actin相聯(lián)系的結(jié)構(gòu)域(act1，act2)，SPAR還可以通過結(jié)構(gòu)域GKBD與PSD-95相聯(lián)系，而PSD-95被發(fā)現(xiàn)與樹突棘密切相關(guān)。因此，我們有充足的理由推測SPAR與樹突棘密切相關(guān)。本研究擬通過觀察不同發(fā)育時(shí)期SPAR及SPARmRNA在小鼠腦組

6、織中的表達(dá)分布，探討SPAR在腦發(fā)育中可能的作用；并通過比較KO與WT小鼠腦組織中SPAR及SPARmRNA表達(dá)的不同，探討SPAR表達(dá)是否受FMRP的影響，為研究脆性X綜合癥的發(fā)病機(jī)理提供一定的依據(jù)。 [材料和方法]1.實(shí)驗(yàn)動物：本研究采用的實(shí)驗(yàn)動物為FMR1基因敲除型(KO)純合子(-/-)及其野生型(WT)純合子(+/+)FVB近交系小鼠。 2.實(shí)驗(yàn)動物基因型鑒定：用PCR法檢測實(shí)驗(yàn)小鼠的FMR1基因片斷，用免疫印

7、跡法檢測FMRP的表達(dá)。 3.檢測SPAR在小鼠腦區(qū)的表達(dá)與分布：第一部分，用免疫組化和蛋白印記法觀察SPAR在小鼠腦區(qū)中的分布及表達(dá)。將小鼠分為成年(6周)KO組(KO6W組)、成年WT組(WT6W組)、幼年(1周)KO組(KO1W組)和幼年WT組(WT1W組)4組，每組10只。分別取每組實(shí)驗(yàn)動物腦組織做冰凍切片，用生物素標(biāo)記、DAB顯色免疫組化法并在顯微鏡下觀察SPAR的分布及在海馬和皮層中的表達(dá)情況。分別提取每組實(shí)驗(yàn)動物海

8、馬、皮層的全細(xì)胞蛋白，進(jìn)行蛋白定量，將蛋白進(jìn)行電泳分離、轉(zhuǎn)膜，與SPAR抗體反應(yīng)后，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光劑對蛋白進(jìn)行檢測。第二部分，海馬神經(jīng)元培養(yǎng)后用蛋白印跡法檢測SPAR的表達(dá)。將新生小鼠分為KO組和WT組分布進(jìn)行海馬神經(jīng)元的原代培養(yǎng)，共培養(yǎng)10批。培養(yǎng)到第7天后每組神經(jīng)元各取部分抽提蛋白，用蛋白印跡法檢測SPAR的表達(dá)。 4.檢測SPARmRNA在小鼠腦區(qū)中的分布和表達(dá)：取小鼠分為成年(6周)KO組(KO6W組)、成年WT組(WT6

9、W組)、幼年(10天)KO組(KO10d組)和幼年WT組(WT10d組)4組，每組10只。分別取腦組織做冰凍切片，用地高辛標(biāo)記、DAB顯色原位雜交法檢測SPARmRNA的分布和表達(dá)。 5.圖像采集：免疫組化，原位雜交的結(jié)果用圖象分析儀分別對大腦皮質(zhì)、海馬的DAB顯色的平均光密度值(meanopticaldensity，MOD)進(jìn)行采集，蛋白印跡的結(jié)果用灰度分析軟件掃描所得蛋白質(zhì)條帶，得出SPAR表達(dá)圖像峰面積值，與β-actin

10、表達(dá)峰面積值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。 6.統(tǒng)計(jì)：對兩個(gè)年齡組之間及兩個(gè)基因型之間海馬和皮層的平均光密度值及蛋白印跡所得的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)值用配對t檢驗(yàn)比較。用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P值小于0.05為差異有顯著性。 [結(jié)果]1.FVB小鼠腦區(qū)中SPAR的分布：SPAR在KO及WT小鼠各個(gè)腦區(qū)普遍表達(dá)，尤其在海馬、皮層表達(dá)豐富。大腦皮質(zhì)中以紋狀皮質(zhì)、運(yùn)動皮質(zhì)、梨狀皮質(zhì)為主；海馬各區(qū)均有高密度信號，以齒狀核為主；大腦的核團(tuán)中，在

11、第三腦室周乳頭體前核、丘腦、尾狀核、韁核、內(nèi)囊、杏仁核等處濃染；胼胝體上僅有少量分布。 2.SPAR的表達(dá)：將不同基因型小鼠免疫組化、蛋白印跡法檢測的結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)KO6W組及KO1W中皮質(zhì)、海馬部位SPAR的表達(dá)均顯著低于野生型，在培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中KO組SPAR表達(dá)顯著低于WT組。不同年齡組比較，KO1W組及WT1W組中皮質(zhì)、海馬部位SPAR的表達(dá)顯著高于KO6W組及WT6W組。P值均小于0.05。 3.SPAR

12、mRNA的表達(dá)：不同基因型比較，KO6W組及KO10d中皮質(zhì)、海馬部位SPARmRNA的表達(dá)均顯著低于野生型。不同年齡組比較，KO10d組及WT10d組中皮質(zhì)、海馬部位SPARmRNA的表達(dá)顯著高于KO6W組及WT6W組。P值均小于0.05。 [結(jié)論]SPAR及SPARmRNA在FVB小鼠各個(gè)腦區(qū)中普遍表達(dá)，在海馬、皮層等神經(jīng)元聚集處表達(dá)尤為豐富。在幼年小鼠中表達(dá)高而成年小鼠中降低，表明SPAR的表達(dá)與年齡相關(guān)。FMR1基因敲除