敲除Tsc1基因?qū)π∈笕橄俳M織的影響研究.pdf

1、背景及目的：
　　Tsc1和Tsc2基因的名字來源于結(jié)節(jié)性硬化癥(Tuberous sclerosis complex，Tsc)，這是一種嚴(yán)重的常染色體顯性遺傳疾病，當(dāng)Tsc1和Tsc2中的一個(gè)或兩個(gè)基因發(fā)生突變就會(huì)造成結(jié)節(jié)性硬化癥(TSC)。結(jié)節(jié)性硬化癥(TSC)的特點(diǎn)是多個(gè)器官和組織，包括真皮，平滑肌，腎和神經(jīng)系統(tǒng)形成錯(cuò)構(gòu)瘤。正由于Tsc1和Tsc2基因突變會(huì)帶來嚴(yán)重的后果，這兩個(gè)基因的功能受到了廣泛的關(guān)注和研究。由Tsc1基

2、因編碼的hamartin蛋白質(zhì)和由Tsc2基因編碼的tuberin蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)共同形成功能性異二聚體（TSC1/TSC2復(fù)合物），該復(fù)合物具有GTP酶激活蛋白(GAP)活性，在控制細(xì)胞大小，細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖的信號通路中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。TSC1和TSC2蛋白通過它們各自的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域相互結(jié)合。TSC2蛋白質(zhì)的C-末端含有GAP結(jié)構(gòu)域，而TSC1蛋白則負(fù)責(zé)保護(hù)TSC2蛋白不受泛素介導(dǎo)的降解。研究表明，當(dāng)在果蠅體內(nèi)突變失活Tsc1或T

3、sc2中任一個(gè)基因，所引起的表型是相同的。因此，干擾或敲除Tsc1或Tsc2中的任何一個(gè)，都能有效抑制TSC1/TSC2復(fù)合物發(fā)揮生物學(xué)作用。
　　哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一種絲氨酸-蘇氨酸激酶，屬于磷脂激酶相關(guān)激酶家族，它是TSC1/TSC2復(fù)合物的重要下游靶分子。mTOR主要以兩種蛋白復(fù)合物的形式存在于細(xì)胞中并發(fā)揮激酶活性:mTOR復(fù)合物1(mTOR co

4、mplex1，mTORC1)和mTOR復(fù)合物2(mTORcomplex2，mTORC2)。mTORC1由mTOR以及4個(gè)調(diào)節(jié)蛋白:Raptor、PRAS40、mLST8和DEPTOR共同構(gòu)成。其所介導(dǎo)的信號通路負(fù)責(zé)接收作用于細(xì)胞的營養(yǎng)、能量、應(yīng)激等信號，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)翻譯，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞生長、增殖與自噬。小GTP酶Rheb(Ras-homology enriched in brain)是mTORC1的直接上游激活蛋白，而Rheb的活性由TSC

5、1/TSC2復(fù)合物控制。TSC1/TSC2復(fù)合物與GTP結(jié)合狀態(tài)的Rheb結(jié)合，并將GTP水解，轉(zhuǎn)為GDP結(jié)合狀態(tài)的Rheb喪失激酶活性，無法激活其下游的mTORC1。因此，TSC1/TSC2復(fù)合物實(shí)際上發(fā)揮著抑制mTORC1活性的作用。當(dāng)營養(yǎng)、能量等信號刺激時(shí)，TSC1/TSC2復(fù)合物被磷酸化，導(dǎo)致它們與Rheb的結(jié)合被解除，Rheb的激酶活性恢復(fù)，進(jìn)而激活mTORC1。當(dāng)Tsc1或Tsc2基因缺失時(shí)，也就失去了TSC1/TSC2復(fù)合

6、物對Rheb活性的抑制，從而導(dǎo)致mTORC1持續(xù)性激活。S6K和4EBP-1是位于mTORC1下游的兩個(gè)重要效應(yīng)蛋白，他們所調(diào)控的信號通路都與促進(jìn)蛋白質(zhì)合成有關(guān)，因而在細(xì)胞生長方面發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。其中，S6K被mTORC1磷酸化激活后，可進(jìn)一步磷酸化下游的核糖體蛋白S6，磷酸化的S6(p-S6)促進(jìn)核糖體蛋白合成。因此，p-S6通常被視為mTORC1活化的指標(biāo)。除了mTORC1，AKT也是調(diào)控細(xì)胞增殖與存活的重要蛋白。為了控制細(xì)胞的有

7、序生長與增殖，促進(jìn)細(xì)胞生長的信號不能被無限放大。因此，在mTORC1和AKT之間存在著負(fù)反饋調(diào)節(jié)。mTORC1激活的S6K一方面磷酸化S6促進(jìn)蛋白質(zhì)翻譯，另一方面則通過磷酸化胰島素受體底物-1(IRS-1)而破壞IRS-1與胰島素受體或胰島素樣生長因子受體的結(jié)合，從而使胰島素或胰島素樣生長因子信號不能正常傳遞到AKT分子，進(jìn)而抑制AKT活性。這條負(fù)反饋調(diào)節(jié)通路在控制細(xì)胞生長和增殖方面起到重要的作用。
　　組織和器官發(fā)育需要適當(dāng)?shù)募?xì)

8、胞生長，增殖和凋亡，由此可推斷mTORC1信號在組織器官發(fā)育中必定發(fā)揮著重要作用。然而，Tsc1或Tsc2基因全身敲除的胚胎致死性阻礙了人們對mTORC1信號在組織器官發(fā)育中的作用的研究。在一些重要組織器官——比如乳腺的發(fā)育中，mTORC1信號起著怎樣的作用尚未闡明。我們的研究采用Cre-LoxP系統(tǒng)建立乳腺管腔乳腺上皮細(xì)胞特異性敲除Tsc1的小鼠模型，這種小鼠能夠正常出生、成長、進(jìn)入性成熟期，是研究mTORC1信號與乳腺發(fā)育的理想模型

9、。有趣的是，我們的研究發(fā)現(xiàn)敲除小鼠乳腺上皮細(xì)胞Tsc1基因后，并沒有如預(yù)期般造成乳腺上皮細(xì)胞過度增生，反而明顯抑制了小鼠乳腺導(dǎo)管的發(fā)育。進(jìn)一步的研究證明，適度的mTORC1活性對于青春期小鼠乳腺發(fā)育的極為重要。
　　方法：
　　利用LoxP-flanked Tsc1(Tsc1 L/L)小鼠及MMTVCre+小鼠雜交構(gòu)建乳腺上皮細(xì)胞特異性敲除Tsc1的模型小鼠(Tsc1L/LMMTVCre+);通過Tsc1L/wt小鼠與MMT

10、VCre+小鼠雜交獲得Tsc1未被敲除的Tsc1wt/wtMMTVCre+小鼠作為正常對照。
　　小鼠于出生后4-6周處死，取第4對乳腺脂肪墊通過全乳腺包埋染色(Wholemount staining)觀察乳腺發(fā)育情況，在高倍鏡下計(jì)數(shù)乳腺二級導(dǎo)管數(shù)量及終末腺泡(TEB)數(shù)量。利用BrdU法檢測乳腺上皮細(xì)胞增殖，利用TUNEL法檢測乳腺上皮細(xì)胞凋亡。通過免疫組織化學(xué)法檢測乳腺上皮TSC1、p-S6、p-PDK1、p-AKT(ser3

11、08)、p-AKT(ser473)、IRS-1、ERα、cyclin D1、cyclin E、CDK4、CDK2、p-Rb及p27kip1的表達(dá)。
　　雷帕霉素逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn):4周大的小鼠給予腹腔注射雷帕霉素0.1 mg/kg，每2天1次，連續(xù)2周;取相同基因型相同周齡的小鼠腹腔注射生理鹽水作為對照。2周后處死小鼠，進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)。
　　結(jié)果：
　　1.成功建立了乳腺上皮特異性敲除Tsc1基因的小鼠模型;
　　2.Tsc

12、1基因敲除抑制小鼠乳腺導(dǎo)管發(fā)育，使小鼠乳腺上皮細(xì)胞增殖降低而凋亡增加;
　　3.Tsc1基因敲除乳腺上皮細(xì)胞的p-S6表達(dá)上調(diào)，mTORC1抑制劑雷帕霉素可逆轉(zhuǎn)該小鼠乳腺p-S6的上調(diào)并一定程度上恢復(fù)乳腺導(dǎo)管發(fā)育，說明mTORC1活性增高導(dǎo)致該小鼠乳腺發(fā)育障礙;同時(shí)，相同劑量的雷帕霉素作用于正?；蛐托∈笠惨鹑橄賹?dǎo)管發(fā)育障礙，提示適當(dāng)?shù)膍TORC1活性對乳腺正常發(fā)育至關(guān)重要;
　　4.Tsc1基因敲除乳腺上皮細(xì)胞的AKT蛋

13、白活性下調(diào)，該下調(diào)可被雷帕霉素逆轉(zhuǎn)，提示mTORC1持續(xù)激活對AKT的負(fù)反饋抑制可能是導(dǎo)致乳腺上皮細(xì)胞增殖抑制、凋亡增加的機(jī)制之一;
　　5.Tsc1基因敲除抑制乳腺上皮細(xì)胞的ERα及IRS-1的核內(nèi)表達(dá)下調(diào)，該下調(diào)可被雷帕霉素逆轉(zhuǎn)，提示ERα的核內(nèi)信號通路被抑制可能是Tsc1基因敲除導(dǎo)致乳腺發(fā)育障礙的機(jī)制之一;
　　6.Tsc1基因敲除乳腺上皮的細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1，Cyclin E，CDK2及CDK4的表達(dá)

14、下調(diào)，該下調(diào)可被雷帕霉素逆轉(zhuǎn)，提示Tsc1基因敲除可能通過下調(diào)細(xì)胞周期蛋白表達(dá)抑制乳腺上皮細(xì)胞增殖，從而導(dǎo)致乳腺導(dǎo)管發(fā)育障礙。
　　結(jié)論：
　　綜上所述，本課題研究敲除Tsc1基因在小鼠乳腺導(dǎo)管發(fā)育中的作用，發(fā)現(xiàn)適當(dāng)?shù)膍TORC1活性對小鼠青春期乳腺導(dǎo)管的發(fā)育至關(guān)重要。mTORC1持續(xù)激活或者活性不足都會(huì)導(dǎo)致青春期小鼠乳腺導(dǎo)管發(fā)育障礙。Tsc1基因敲除導(dǎo)致乳腺發(fā)育受阻的分子機(jī)制可能包括:1，mTORC1的持續(xù)性激活負(fù)反饋抑制