GABA能神經(jīng)元在FMR1基因敲除鼠癲癇發(fā)病機制中作用的研究.pdf

1、研究目的和內(nèi)容：通過比較FMR1 KO鼠和WT鼠海馬GAD、GABAAR α5表達的改變，了解GABA能神經(jīng)元數(shù)量和結(jié)構(gòu)變化是否為FMR1 KO鼠癲癇易感的基礎(chǔ)。通過比較FMR1 KO鼠和WT鼠海馬組織以及GABA 能神經(jīng)元NaV1.1蛋白表達的改變，探討NaV1.1對FMR1 KO鼠神經(jīng)元鈉電流可能的影響。通過檢測FMR1 KO鼠和WT鼠海馬中間神經(jīng)元和錐體神經(jīng)元鈉電流的電生理學變化，從而進一步在功能上探討抑制性神經(jīng)元興奮性改變在FM

2、R1 KO鼠癲癇形成中的作用。
　　 研究方法：
　　 1.FMR1基因敲除鼠模型的鑒定
　　 FVB品系小鼠飼養(yǎng)在19～21 ℃自然光條件下，自由獲取食物和水分。選取14-17 天齡的FMR1 KO鼠和WT 鼠，一般選取雄性小鼠，實驗前取尾提取DNA，PCR技術(shù)進行基因型鑒定。
　　 2.熒光實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測
　　 目標基因的表達量在解剖顯微鏡下分離海馬組織。在玻璃勻漿器中加入海馬腦組織

3、和RNAisoReagent Trizol 研磨，提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄cDNA 后進行熒光實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測GAD、GABAAR α5、NaV1.1和內(nèi)參GAPDH的mRNA，并進行相對定量分析。
　　 3．Western blotting檢測
　　 目標蛋白表達水平同上方法分離海馬組織，提取蛋白后檢測蛋白濃度，進行Western blotting。電泳轉(zhuǎn)膜后分別使用GAD、GABAAR α5、NaV1.1和內(nèi)參β

4、-actin的抗體孵育，然后孵育相應(yīng)二抗，曝光顯影后對條帶進行定量分析。
　　 4.免疫組化和免疫熒光雙標檢測
　　 目標蛋白共表達水平多聚甲醛灌注小鼠，冰凍切片，做GAD細胞免疫組化，統(tǒng)計細胞數(shù)目，并孵育GAD和NaV1.1的抗體以及相應(yīng)二抗，在熒光顯微鏡下觀察，GAD 神經(jīng)元和NaV1.1 共表達分析。
　　 5．膜片鉗檢測
　　 鈉電流特征急性分離海馬神經(jīng)元，分別選取中間神經(jīng)元和錐體神經(jīng)元，在全細胞

5、電壓鉗模式下給予標準刺激方案，根據(jù)所得電流數(shù)據(jù)建立快速鈉電流的激活曲線、失活曲線和失活后復(fù)活曲線，計算持續(xù)鈉電流的最大波幅，激活電壓和電流密度等進行比較。
　　 6．統(tǒng)計學分析
　　 計量資料以均數(shù)±標準差(x±s)表示，統(tǒng)計方法用SPSSl6.0 for Windows軟件包進行統(tǒng)計分析，采用t 檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義
　　 研究結(jié)果：
　　 1.FMR1 KO鼠和WT鼠海馬GABA能神

6、經(jīng)元數(shù)目和GAD表達的變化
　　 FMR1 KO鼠和WT鼠海馬GABA能神經(jīng)元數(shù)目的比較：FMR1 KO鼠海馬GABA 能神經(jīng)元80±20.134，WT 鼠95.11±14.186，差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.007）；CA1 區(qū)FMR1 KO鼠32.24±7.710，WT 鼠39.59±6.738，差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.002）；CA3 區(qū)FMR1 KO鼠29.94±10.028，WT 鼠35.07±6.324 差異具有

7、統(tǒng)計學意義（P=0.043）；DG 區(qū)FMR1 KO鼠17.82±5.703,WT 鼠20.44±3.545,差異不具有統(tǒng)計學意義（P=0.066）；在mRNA水平的比較：FMR1 KO鼠GAD67表達高于WT 鼠，差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.006）。FMR1 KO鼠和WT 鼠海馬GAD蛋白水平的比較：FMR1 KO鼠GAD67和GAD65的表達均高于WT 鼠，差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.000）；在mRNA水平的比較：FMR1 KO

8、鼠GAD67表達高于WT 鼠，差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.006）。
　　 2.FMR1 KO鼠和WT鼠海馬GABAAR α5表達的變化
　　 FMR1 KO鼠和WT鼠海馬GABAAR α5蛋白水平的比較：FMR1 KO鼠GABAAR α5的表達低于WT 鼠，差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.000）；在mRNA水平的比較：FMR1KO鼠GABAAR α5表達低于WT 鼠，差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.031）。
　　

9、3.FMR1 KO鼠和WT鼠海馬NaV1.1表達的變化
　　 FMR1 KO鼠和WT 鼠海馬NaV1.1 蛋白水平的比較：FMR1 KO鼠Nav1.1的表達高于WT 鼠，差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.000）；在mRNA水平的比較：FMR1 KO鼠Nav1.1的表達高于WT 鼠，差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.000）。
　　 4.FMR1 KO鼠和WT鼠海馬神經(jīng)元GAD和NaV1.1共表達
　　 Nav1.1通道蛋白

10、在海馬區(qū)的神經(jīng)元均有表達：錐體層的錐體神經(jīng)元和齒狀回顆粒層的顆粒細胞胞體（未被GAD 標記）上的表達較弱，NaV1.1 蛋白在錐體層和顆粒層中散在分布的GAD 標記的神經(jīng)元上卻有著比較強的陽性表達。
　　 5.海馬鈉通道電生理特性
　　 5.1.鈉通道的激活FMR1 KO鼠和WT 鼠錐體神經(jīng)元V0.5與k 值分別為：FMR1 KO鼠（n=4）:-34.56±2.23(mV)，4.43±0.35；WT（n=4）:-37.8

11、7±2.18(mV)，4.69±0.41,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05）；FMR1 KO鼠和WT 鼠中間神經(jīng)元：FMR1 KO鼠（n=4）:-32.07±2.06(mV)，4.38±1.11；WT（n=4）:-32.56±1.68(mV)，5.02±0.4，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 1.本研究首次發(fā)現(xiàn)FMR1 KO鼠海馬GABA 能神經(jīng)元數(shù)目降低，其抑制性降低可能是導(dǎo)致FMR1 KO鼠癲癇

12、易感性增高的原因之一，也為進一步研究提供了形態(tài)學的基礎(chǔ)。
　　 2.本研究首次發(fā)現(xiàn)FMR1 KO鼠海馬GABAAR α5蛋白表達減少，提示其介導(dǎo)的中間神經(jīng)元抑制性降低可能是導(dǎo)致FMR1 KO鼠癲癇易感性增高的原因之一。
　　 3.本研究首次在FMR1基因敲除小鼠海馬組織發(fā)現(xiàn)電壓門控鈉離子通道a 亞單位NaVl.1表達水平增高；進一步的電生理研究發(fā)現(xiàn)FMR1 KO鼠錐體神經(jīng)元鈉通道興奮性的增強，中間神經(jīng)元鈉通道興奮性降低。

13、為FMR1 KO鼠癲癇易感性增高提供了電生理依據(jù)。不僅說明NaVl.1表達的增高可能所致是錐體神經(jīng)元鈉通道興奮性增強的原因，而且為中間神經(jīng)元抑制性降低導(dǎo)致FMR1 KO鼠癲癇易感性增高提供了電生理依據(jù)。在細胞水平中間神經(jīng)元鈉通道興奮性降低的原因NaVl.1的表達情況及其與電生理的關(guān)系待進一步研究。
　　 4.本研究顯示FMR1基因敲除小鼠海馬組織GAD和NaVl.1mRNA和蛋白在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平表達均增高，支持FMRP 具有負性