Fmr1敲除小鼠海馬組織microRNA的差異表達及其功能研究.pdf

1、背景：脆性X綜合征（Fragile X syndrome，F(xiàn)XS）是常見的遺傳性智力低下疾病，是由位于Xq27.3的脆性X智力低下基因1（fragile X mental retardation1，F(xiàn)MR1）突變引起脆性X智力低下蛋白（fragile X mental retardation protein，F(xiàn)MRP）表達下降或缺失所致。大部分FXS患者為5′非翻譯區(qū)（CGG）n三核苷酸重復序列的動態(tài)突變，導致其上游CpG島異常甲基化，

2、引起其編碼的FMRP表達下調(diào)或缺失。極少數(shù)則是由于FMR1有義突變或缺失所致。FMRP通過作用于mRNA和microRNA（miRNA）在轉錄水平選擇性地調(diào)控基因表達來參與腦功能的調(diào)控。MiRNAs通過與mRNAs3′非翻譯區(qū)（3′UTR）以反義序列不完全配對的形式，抑制mRNA翻譯或促進mRNA降解影響蛋白表達，參與細胞分化、增殖、凋亡以及各個組織器官的正常發(fā)育。近年來有研究證實，miRNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)高表達，并且某些miRNA已被

3、證實參與神經(jīng)發(fā)生及腦的發(fā)育。有文獻報道，在FXS動物模型中發(fā)現(xiàn)miRNA表達異常，異常表達的miRNA通過形成RNA-誘導的沉默復合體（RISC）或其他途徑作用于靶基因mRNA，影響靶基因mRNA的穩(wěn)定性，導致樹突棘的發(fā)育異常，參與FXS的發(fā)病機制。已有研究證實，F(xiàn)MRP在生物化學以及遺傳學上與miRNA相關通路密切聯(lián)系。FMRP，miRNA都具有選擇性的抑制蛋白翻譯的作用，并且FMRP可以與miRNA成熟過程中的關鍵Dicer酶相互作

4、用，參與miRNA在胞漿中的成熟過程。但是，F(xiàn)MRP作為選擇性的RNA結合蛋白是否在胞核內(nèi)對miRNA的生成產(chǎn)生影響，異常表達的miRNA是否參與FXS的發(fā)病，目前尚無報道。
　　目的：通過分析脆性X綜合征動物模型-Fmr1敲除（KO）小鼠海馬組織miRNA表達情況、成熟過程中pri-miRNA及pre-miRNA的改變，初步探究FMRP對miRNA成熟過程可能的影響；并進一步分析差異表達的miRNA對潛在的靶基因表達調(diào)控的影響，

5、在基因表達調(diào)控水平上進一步揭示該疾病的發(fā)病機制。
　　方法：本研究通過Q-PCR探究Fmr1轉錄本在不同發(fā)育時期小鼠海馬組織中的動態(tài)表達情況，找到合適研究天數(shù)的小鼠，采用miRNA芯片技術分析FVB品系野生型小鼠與Fmr1敲除小鼠海馬組織中miRNA表達譜系在該時間點的改變情況，對芯片結果中差異表達的miRNA采用熒光定量PCR進行驗證，選取改變幅度大于100倍的miRNA，進一步觀察其pri-miRNA和pre-miRNA的表達

6、情況。采用生物信息學軟件對上述明顯上調(diào)的miRNA進行靶基因的預測，采用Gene Ontology分析預測到的靶基因，找到與神經(jīng)系統(tǒng)相關的基因。采用半定量PCR和熒光定量PCR驗證與神經(jīng)系統(tǒng)相關的靶基因在WT與KO鼠中轉錄本含量有無差異。構建Met3′UTR雙熒光素酶真核報告基因表達質(zhì)粒和相關miRNA真核表達質(zhì)粒，將構建的Met3′UTR的質(zhì)粒分別與其相關的miRNA質(zhì)粒瞬時共轉染小鼠神經(jīng)源性N1E115細胞及Neuro2A細胞，采用

7、雙熒光素酶基因報告系統(tǒng)對共轉染質(zhì)粒雙熒光素酶活性變化進行檢測，分析miRNA對靶基因3′UTR活性的影響。
　　結果：⑴通過qRT-PCR檢測不同發(fā)育時期（從胚胎期18天到出生后60天）小鼠海馬組織中Fmr1的表達水平。在P1、P7和P15 Fmr1 mRNA表達水平分別為E18天的0.1、0.6和0.2倍。E18和P60之間表達無差異(P>0.05)。毗鄰兩個發(fā)育時期之間Fmr1表達水平有顯著差異（P<0.001）。⑵通過全基因

8、組miRNA表達譜系分析顯示，與野生型小鼠相比，P7 KO小鼠在1080種miRNA中有38個表達上調(diào)（P<0.001），其中33個上調(diào)高達15~250倍；有26個miRNA表達下調(diào)約2~4倍（P<0.001）。通過qRT-PCR驗證表達上調(diào)大于100倍的9個miRNA，上述miRNA均顯著上調(diào)，與芯片結果相符。⑶通過qRT-PCR檢測9個上調(diào)miRNA的pri-miRNA和pre-miRNA的表達水平。與野生型小鼠相比，9個pre-m

9、iRNA在KO鼠海馬組織中表達上調(diào)約5~10倍。而9個pri-miRNA在KO鼠海馬組織中表達與野生型小鼠相比未見明顯變化。⑷通過生物信息學軟件預測以及分析上述9個表達上調(diào)miRNA的靶基因，有約5000個潛在的靶基因，其中392個與神經(jīng)系統(tǒng)功能相關。392個靶基因中的絕大多數(shù)只受9個miRNA中的1個調(diào)控，小部分靶基因受9個miRNA中的多個調(diào)控。對受其中5~6個miRNA共同調(diào)控的10個靶基因，應用RT-PCR檢測mRNA水平，發(fā)現(xiàn)

10、與野生型小鼠相比，上述10個靶基因mRNA水平在敲除小鼠海馬組織中的表達均明顯下調(diào)。⑹已預測Met3′UTR及調(diào)控其表達miRNA的相關信息，構建Met3′UTR及其相關miRNA（miR-34b， miR-340，miR-148a和miR-101a）的質(zhì)粒，通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測預測的miRNA是否可以通過作用于Met3′ UTR的序列下調(diào)報告基因的表達。將psi-CHECK2-Met3′UTR質(zhì)粒以及相關的pCMV-EGFP-p

11、re-miRNA質(zhì)粒共轉染小鼠神經(jīng)源性N1E-115和Neuro-2A細胞，發(fā)現(xiàn)miR-34b，miR-340和miR-148a可以通過與Met3′UTR的序列相互作用下調(diào)報告基因的表達，活性約為陽性對照組的75％-50%。
　　結論：FMRP可能參與miRNA由pri-miRNA轉變?yōu)閜re-miRNA的轉錄后加工成熟過程，選擇性調(diào)控miRNA表達。KO鼠表達上調(diào)的miRNA通過降低靶基因mRNAs的表達，可能參與FXS的發(fā)病機