Pax-8基因敲除小鼠心臟中NR4A1基因表達上調.pdf

1、目的:利用基因芯片,比較Pax-8基因敲除純合子(Pax-8 KO-/-)和雜合子(Pax-8KO+/-)兩組小鼠基因表達水平,找出差異表達的基因,并經半定量RT-PCR和熒光實時定量PCR技術初步篩選出轉錄因子Pax-8的下游基因。
　　 方法:
　　 1.Pax-8基因敲除純合子小鼠的獲得:選擇Pax-8 KO+/-20只小鼠,雌雄各10只,雌的Pax-8KO+/-和雄的Pax-8KO+/-交配可獲得Pax-8 KO

2、-/-。
　　 2.Pax-8基因敲除小鼠的基因型鑒定:提取小鼠DNA運用PCR法鑒定小鼠基因型。
　　 3.芯片雜交和數據分析:取Pax-8 KO-/-組與Pax-8 KO+/-組出生第一天(P0)小鼠各3只,TRIzol法常規(guī)提取心臟組織總RNA,經紫外吸收測定和變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA質量,只有28S/18S rRNA帶密度比值為1.5-2.0且A260/A280吸收率為1.8-2.0者才繼續(xù)進行之后的操作,參

3、照上海生物芯片有限公司試劑盒說明書反轉錄標記cDNA探針并純化,Cy3-dUTP標記Pax-8 KO-/-cDNA,Cy5-dUTP標記Pax-8 KO+/-cDNA,將探針加在基因芯片上,用蓋玻片封片室溫晾干,芯片結果采用Axon公司的Gene Pix4100掃描,Gene PixPro4.0軟件分析Cy3和Cy5兩種熒光信號的強度和比值,用以下2個條件為判斷基因差異表達的標準:①Cy3和Cy5信號比值>2.0為表達上調,<0.5為表

4、達下調,0.5-2.0為不存在顯著表達差異。②Cy3和Cy5信號比值其中之一必須>200或其中之一<800及Cy5/Cy3在0.1-10之間,作為判斷基因差異表達的標準,找出兩組有差異表達的基因。
　　 4.半定量RT-PCR:每組(Pax-8 KO-/-組,Pax-8 KO+/-組)各取出生第一天(P0)小鼠3只,用TRIzol試劑提取心臟組織總RNA(按TRIzol說明書操作),取每組總RNA進行逆轉錄反應,按照不同引物條件

5、進行半定量RT-PCR。
　　 5.熒光定量RT-PCR:每組取出生第一天(P0)小鼠各3只,常規(guī)提取各只動物心臟組織總RNA作逆轉錄,用NR4A1實時定量RT-PCR引物(由上海英駿生物技術有限公司合成)進行熒光定量PCR檢測。用ABI7500 FAST型熒光定量PCR儀檢測,試驗重復3次。通過比較△Ct的方法進行NR4A1表達的定量分析,NR4A1的相對表達量用2-△Ct表示。Ct為每個反應管內的熒光信號到達設定的閾值時所歷

6、的循環(huán)數,△Ct為NR4A1 Ct值與內參Beta-actin Ct值之差。
　　 結果:
　　 1.通過基因芯片對31,802個已知基因進行分析,發(fā)現與Pax-8 KO+/-組相比,在Pax-8 KO-/-組中25個基因表達下調,另外17個基因表達上調,其中涉及細胞周期,直接參與代謝的酶,細胞信號轉導及核轉錄因子等基因。
　　 2.通過半定量RT-PCR法初步驗證基因芯片篩選的基因發(fā)現NR4A1的PCR產物在第

7、28個PCR循環(huán)周期開始,Pax-8 KO-/-組明顯多于Pax-8 KO+/-組和Pax-8 KO-/+組。說明NR4A1基因在Pax-8 KO-/-小鼠中表達上調。
　　 3.通過熒光定量RT-PCR進一步驗證發(fā)現NR4A1(nuclear receptorsubfamily4,group A,member1)在Pax-8 KO-/-組比Pax-8 KO+/-組上調(1.53±0.08)倍(P<0.01),而作為內部對照的G