NRG1-ErbB4信號在Fmr1基因敲除鼠腦組織中的改變及意義.pdf

1、脆性X綜合征（fragile X syndrome，F(xiàn)XS）是常見的遺傳性智力低下性疾病之一，其發(fā)病率男性約為1/4000，女性約為1/8000。其根本病因是脆性 X智障基因（fragile X mental retardation1，F(xiàn)MR1）5，端非編碼區(qū)（CGG）n三核苷酸重復(fù)序列不穩(wěn)定擴(kuò)增及其相鄰部位CpG島異常甲基化，使Fmr1基因失活，導(dǎo)致其編碼的產(chǎn)物--脆性X智力低下相關(guān)蛋白（fragile X mental retard

2、ation protein，F(xiàn)MRP）表達(dá)減少或缺失。臨床上主要表現(xiàn)為程度不等的智力障礙、注意力缺陷、孤獨(dú)癥及活動過度等，此外有報(bào)道20％-25%的FXS患者并發(fā)癲癇。脆性 X綜合征的模型小鼠Fmr1基因敲除（knockout，KO）小鼠的許多行為學(xué)表現(xiàn)與脆性X綜合征患者非常相似，包括癲癇易感性。除聽源性驚厥易感性增加外，我們課題組前期研究還發(fā)現(xiàn)Fmr1KO鼠較野生（wild type，WT）小鼠具有更高的熱性驚厥易感性。有研究表明抑制

3、性中間神經(jīng)元功能降低可導(dǎo)致大腦皮層興奮性增加，從而導(dǎo)致 FXS癲癇的發(fā)生。
　　我們課題組前期研究的結(jié)果也支持中間神經(jīng)元的異常參與了FXS發(fā)病機(jī)制：與WT小鼠相比，KO小鼠腦組織中小白蛋白[parvalbumin，PV)及谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）神經(jīng)元數(shù)量減少；海馬抑制性中間神經(jīng)元上Ⅰ型電壓門控性鈉通道（Sodium channel,voltage-gated,alpha1，Nav1.

4、1）電流密度降低。我們課題組還發(fā)現(xiàn)2周齡Fmr1KO小鼠紋狀皮質(zhì)、顳聽皮質(zhì)、梨狀皮質(zhì)的PV細(xì)胞面積較同齡WT小鼠縮小。4周齡Fmr1KO與WT小鼠比較，相應(yīng)的CA2、CA3、顳聽皮質(zhì)以及梨狀皮質(zhì)的PV細(xì)胞面積較同齡WT小鼠減小。而我們課題組也發(fā)現(xiàn)14-17天齡的Fmr1KO小鼠GABAARα5蛋白的的表達(dá)以及在mRNA水平均低于WT小鼠。目前大量研究表明,神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1（Neuregulin1）及其受體ErbB4在神經(jīng)元發(fā)育、突觸功能及

5、可塑性、神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞、以及N-甲基D-天冬氨酸的調(diào)節(jié)，GABAA受體、乙酰膽堿受體亞基的表達(dá)以及在維持神經(jīng)環(huán)路的平衡中起著至關(guān)重要的作用。因此本課題組提出假設(shè)：KO小鼠中NRG1-ErbB4信號的改變有可能是導(dǎo)致PV陽性中間神經(jīng)元數(shù)量減少及結(jié)構(gòu)改變的原因之一。本研究通過比較不同年齡組 Fmr1 KO鼠和WT鼠腦組織中 NRG1和ErbB4蛋白表達(dá)量，以及NRG1和ErbB4陽性神經(jīng)元數(shù)量的差異，并觀察比較PV陽性中間神經(jīng)元上ErbB4

6、分布的變化，探討NRG1-ErbB4信號在FXS中癲癇易感性增高中的作用。
　　材料與方法：
　　FVB品系小鼠在19～21℃自然光的條件下飼養(yǎng)，讓它們自由獲取食物和水分。實(shí)驗(yàn)前取其尾巴提取DNA，PCR技術(shù)鑒定小鼠基因型。隨機(jī)選取出生后2周、4周雄性Fmr1基因敲除（knockout mouse，KO小鼠，KO2w和KO4w）用免疫組化法檢測NRG1和ErbB4神經(jīng)元數(shù)量（每組各取6只同窩小鼠）；蛋白印跡法檢測NRG1和E

7、rbB4蛋白含量（每組各取3只同窩小鼠）；免疫熒光雙標(biāo)記法檢測ErbB4蛋白在PV陽性中間神經(jīng)元上的表達(dá)（每組各取3只同窩小鼠）。上述所有實(shí)驗(yàn)都以同齡的雄性野生型（wild type，WT）小鼠作為對照組。
　　結(jié)果：
　　1. KO與WT小鼠腦組織NRG1陽性神經(jīng)元數(shù)量的比較
　　KO2w和KO4w小鼠大腦皮質(zhì)、海馬CA1及CA3區(qū)NRG1陽性神經(jīng)元的數(shù)量均較同齡WT小鼠減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而在齒狀回區(qū)，KO2w

8、和KO4w小鼠NRG1陽性神經(jīng)元均較同齡WT小鼠增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2. KO與WT小鼠腦組織ErbB4陽性神經(jīng)元數(shù)量的比較
　　KO2w小鼠大腦皮質(zhì)、海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)及齒狀回區(qū)ErbB4陽性神經(jīng)元的數(shù)量均較WT2w小鼠減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；KO4w小鼠大腦皮質(zhì)、海馬CA3區(qū)ErbB4陽性神經(jīng)元的數(shù)量均較WT4w小鼠減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而海馬CA1區(qū)及齒狀回區(qū)與WT4w小鼠相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

9、　　3. KO與WT小鼠大腦皮質(zhì)、海馬組織中NRG1、ErbB4蛋白表達(dá)量的比較
　　KO2w和KO4w小鼠大腦皮質(zhì)NRG1、ErbB4含量分別較WT2w和WT4w小鼠減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；KO2w和KO4w小鼠海馬中NRG1、ErbB4含量分別較WT2w和WT4w小鼠減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4. KO與WT小鼠腦組織PV陽性神經(jīng)元ErbB4表達(dá)量的比較
　　KO2w和KO4w小鼠皮質(zhì)、海馬CA1及CA3區(qū)PV

10、與ErbB4共標(biāo)記的神經(jīng)元上，共定位陽性神經(jīng)元均較WT2w和WT4w小鼠減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而海馬齒狀回區(qū)PV與ErbB4共表達(dá)的神經(jīng)元與同齡小鼠相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　KO2w和KO4w小鼠大腦皮質(zhì)及海馬NRG1、ErbB4陽性神經(jīng)元數(shù)量、NRG1、ErbB4表達(dá)量以及PV陽性神經(jīng)元ErbB4表達(dá)量均減少，提示NRG1-ErbB4信號的降低可能與KO小鼠PV陽性GABA能中間神經(jīng)元的減少有關(guān)，可能在FX