FMR1基因的可變剪接及其意義.pdf

1、脆性X綜合征（fragile X syndrome，F(xiàn)XS）是一種常見(jiàn)的遺傳性智力低下疾病。其致病基因----脆性X智力障礙1基因（fragile X mental retardation1 gene，F(xiàn)MR1）定位克隆于Xq27.3，長(zhǎng)38Kb，由17個(gè)外顯子和16個(gè)內(nèi)含子組成，編碼一個(gè)選擇性RNA結(jié)合蛋白，稱為脆性X智力障礙蛋白（fragile X mental retardation protein，F(xiàn)MRP)。已有的研究表明，F(xiàn)

2、MR1基因存在復(fù)雜的可變剪接表達(dá)，且可變剪接參與了FMR1基因功能和活性的調(diào)節(jié)。但是，對(duì)不同異構(gòu)體的生理功能仍知之甚少。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴為了研究物種間FMR1基因的可變剪接表達(dá)差異，利用公認(rèn)的比較基因組學(xué)分析工具，對(duì)不同物種FMR1基因保守序列、內(nèi)含子序列、可變剪接表達(dá)譜進(jìn)行比較分析，并對(duì)FMR1基因各外顯子進(jìn)行選擇壓力分析，籍此預(yù)測(cè)可變剪接對(duì)FMR1基因的影響。結(jié)果表明，各物種間FMR1基因存在不同程度的可變剪接，并

3、存在物種特異性剪接方式；可變剪接與FMR1的功能進(jìn)化密切相關(guān)，特別是外顯子12的剪接。⑵為進(jìn)一步研究人類FMR1的可變剪接表達(dá)，利用T克隆-測(cè)序技術(shù)，對(duì)人不同組織細(xì)胞FMR1基因可剪表達(dá)譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了兩種新的可變剪接產(chǎn)物，結(jié)合本課題組之前發(fā)現(xiàn)的新的剪接產(chǎn)物，表明人類FMR1基因可變剪接遠(yuǎn)比已知的要復(fù)雜得多；含有編碼區(qū)全長(zhǎng)序列的剪接產(chǎn)物(ISO1)的表達(dá)豐度較低，而人體中主要的剪接產(chǎn)物是ISO17和ISO7，均涉及外顯子12跳躍的剪接

4、，但不同組織中兩者的比例并不一致。⑶為了研究該外顯子的插入對(duì)FMRP的影響，利用分子克隆技術(shù)，構(gòu)建含全長(zhǎng)編碼區(qū)序列真核表達(dá)載體：pEGFP-N2-FMR1和含新型外顯子的FMR1基因真核表達(dá)載體：pEGFP-N2-△FMR1。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T胞和HeLa細(xì)胞后，熒光顯微鏡觀察GFP融合蛋白表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，含新型外顯子的融合蛋白細(xì)胞內(nèi)定位發(fā)生了改變。⑷為了進(jìn)一步研究該外顯子的插入對(duì)FMRP功能的影響，利用分子克隆技術(shù)，構(gòu)建含新型