柴胡桂枝湯揮發(fā)油對Fmr1基因敲除小鼠的治療作用和機(jī)制探討.pdf

1、第一章Fmr1基因敲除小鼠模型的鑒定
　　 目的：研究Fmr1小鼠是否存在與人類脆性X綜合征(FXS)患者相似的異常行為，評價(jià)是否可以作為FXS的疾病模型。
　　 方法：以PCR和免疫印跡技術(shù)對Fmr1基因敲除(KO)小鼠和野生型(WT)小鼠進(jìn)行基因型鑒定;HE和Golgi染色方法分別觀察2組動(dòng)物睪丸和腦內(nèi)樹突棘形態(tài);分別對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行聽源性驚厥(AGS)觀察，以水迷宮、避暗、跳臺(tái)方法檢測動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶水平，以曠場、高架十

2、字迷宮和自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)檢測動(dòng)物探索行為能力。
　　 結(jié)果：WT小鼠擴(kuò)增出預(yù)期約為500bp的DNA片斷，KO小鼠則是800bp的DNA片斷，KO小鼠無FMRP蛋白表達(dá)，樹突棘長度明顯增長，密度顯著增加，KO雄性小鼠有巨睪征;AGS易感性比WT明顯增高(P＜0.05);Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)的定向航行實(shí)驗(yàn)顯示，KO小鼠的潛伏期和穿越平臺(tái)次數(shù)與WT小鼠相比有明顯增多（P＜0.05）;空間搜索實(shí)驗(yàn)顯示，KO小鼠在目標(biāo)象限停留時(shí)間明顯短于

3、WT小鼠的停留時(shí)間(P＜0.05);避暗實(shí)驗(yàn)和跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)顯示，KO小鼠潛伏期明顯短于WT小鼠，而錯(cuò)誤次數(shù)明顯增多（P＜0.05）;曠場實(shí)驗(yàn)顯示，KO小鼠在中央?yún)^(qū)域停留時(shí)間及進(jìn)入次數(shù)明顯多于WT小鼠(P＜0.05);KO小鼠與WT小鼠相比，總運(yùn)動(dòng)路程明顯增多，速度明顯增快（P＜0.05）;高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)顯示，KO小鼠在開放臂活動(dòng)時(shí)間、次數(shù)以及路程均明顯多于WT小鼠（P＜0.05）;自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)顯示，KO小鼠的活動(dòng)次數(shù)明顯多于WT小鼠（P＜

4、0.05），而站立次數(shù)明顯少于WT小鼠（P＜0.05）。
　　 結(jié)論：從基因型、蛋白表達(dá)譜、形態(tài)學(xué)及行為學(xué)等方面結(jié)果提示Fmr1基因敲除小鼠具有人類脆性X綜合征類似的表型，可作為FXS疾病模型用于論文的后續(xù)研究，而且這些表型與FMRP表達(dá)缺失有關(guān)。
　　 第二章胡桂枝湯揮發(fā)油對Fmr1基因敲除小鼠異常行為的干預(yù)
　　 目的：觀察柴胡桂枝湯揮發(fā)油對Fmr1基因敲除小鼠異常行為的干預(yù)。
　　 方法：利用超臨界

5、CO2萃取技術(shù)制備柴胡桂枝湯揮發(fā)油并用GC-MS分析鑒定柴胡桂枝湯揮發(fā)油成分;4周齡KO及WT小鼠按處理方式的不同被隨機(jī)分為藥物處理組（即腹腔注射柴胡桂枝湯揮發(fā)油）、溶媒對照組（即腹腔注射植物油）及空白對照組（即不給予任何處理）。藥物處理組進(jìn)一步按所給濃度的不同繼續(xù)分組，分別對各組動(dòng)物在給藥后進(jìn)行避暗、跳臺(tái)、高架十字迷宮、曠場、自主活動(dòng)和AGS等行為學(xué)觀察。
　　 結(jié)果：經(jīng)GC-MS分析鑒定柴胡桂枝湯揮發(fā)油含有28種組分。其中，

6、最主要成分姜辣素占31.94％，丁香酚占18.01％，單萜類物質(zhì)占12.34％，3-丁基-1(3H)-異苯并呋喃酮占9.34％，肉桂類物質(zhì)占8.03％。
　　 曠場實(shí)驗(yàn)顯示，隨柴胡桂枝湯揮發(fā)油濃度的增加，KO和WT小鼠的平均速度、穿越中央格次數(shù)、總路程等逐漸降低。高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)顯示，KO小鼠給予柴胡桂枝湯揮發(fā)油處理后，與KO溶媒組相比，KO小鼠在開放區(qū)域活動(dòng)時(shí)間、次數(shù)以及路程均降低，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。自主活動(dòng)

7、實(shí)驗(yàn)顯示，使用柴胡桂枝湯揮發(fā)油后，KO小鼠的活動(dòng)次數(shù)明顯減少，動(dòng)物站立次數(shù)明顯增多(P＜0.05);跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)顯示，柴胡桂枝湯揮發(fā)油處理后，KO小鼠潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)有明顯改善（P＜0.05），WT小鼠潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)有較少改善。避暗實(shí)驗(yàn)中，柴胡桂枝湯揮發(fā)油處理后，KO小鼠潛伏期延長（P＜0.05），錯(cuò)誤次數(shù)減少（P＜0.05），WT小鼠潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)無明顯改善（P＞0.05）。聽源性驚厥實(shí)驗(yàn)中，隨柴胡桂枝湯揮發(fā)油濃度的增加，KO小鼠的A

8、GS的潛伏期延長，發(fā)作程度降低（P＜0.05），1.5mg/g濃度的柴胡桂枝湯揮發(fā)油能完全抑制AGS的發(fā)生。
　　 結(jié)論：柴胡桂枝湯揮發(fā)油可以改善KO小鼠AGG和運(yùn)動(dòng)過多的發(fā)生，改善學(xué)習(xí)記憶能力，對KO小鼠的異常行為有一定治療作用。
　　 第三章柴胡桂枝湯揮發(fā)油干預(yù)Fmr1基因敲除小鼠聽源性驚厥的可能機(jī)制
　　 目的初步探討柴胡桂枝湯揮發(fā)油干預(yù)Fmr1基因敲除小鼠聽源性驚厥的可能機(jī)制。
　　 方法4周齡K

9、O及WT小鼠按處理方式的不同被隨機(jī)分為藥物處理組（即腹腔注射柴胡桂枝湯揮發(fā)油）、溶媒AGS組、溶媒對照組和空白對照組，進(jìn)一步將藥物處理組和溶媒AGS組給予AGS誘發(fā)，溶媒對照組和空白對照組不給予AGS誘發(fā);以高效液相色譜方法檢測腦中氨基酸水平的變化，以免疫組織化學(xué)方法觀察各組動(dòng)物腦皮質(zhì)及海馬內(nèi)GAD的表達(dá);分別以鄰苯三酚自氧化法、硫代巴比妥法、硝酸還原酶法檢測各組小鼠腦內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)的水平

10、，以Golgi染色方法觀察各組小鼠腦內(nèi)樹突棘形態(tài)變化，初步探討柴胡桂枝湯揮發(fā)油改善KO小鼠AGS的可能機(jī)制。
　　 結(jié)果 KO小鼠腦皮質(zhì)及海馬內(nèi)GAD陽性神經(jīng)元數(shù)量與WT小鼠相比明顯減少（P＜0.05）。
　　 KO溶媒對照組和KO空白對照組（未經(jīng)AGS誘發(fā)）小鼠與WT溶媒對照組和和WT空白對照組相比，腦內(nèi)γ-氨基丁酸及甘氨酸水平明顯降低，谷氨酸水平明顯升高(P＜0.05);KO溶媒對照組與KO空白對照組相比，腦內(nèi)γ-氨

11、基丁酸、甘氨酸，谷氨酸水平無明顯變化;KO溶媒AGS組小鼠經(jīng)AGS誘發(fā)后，與KO溶媒對照組和KO空白對照組相比，腦內(nèi)γ-氨基丁酸水平有明顯降低（P＜0.05）;KO小鼠藥物處理組與KO溶媒AGS組及WT用藥組相比，腦內(nèi)谷氨酸水平均有明顯降低（P＜0.05）。
　　 與WT溶媒AGS對照小鼠相比，KO溶媒AGS組小鼠腦內(nèi)SOD活力明顯降低，MDA和NO水平則明顯增高（P＜0.05）;KO溶媒對照組與KO空白對照組腦內(nèi)SOD、MDA