人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞人源化培養(yǎng)體系的建立和研究.pdf

1、誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（Induced Pluripotent Stem Cell，iPSC）是近年來(lái)干細(xì)胞研究領(lǐng)域中具有里程碑意義的突破。由體細(xì)胞重編程而來(lái)的hiPSC為獲得與患者自身遺傳背景一致的多能干細(xì)胞增加了一個(gè)新途徑，是再生醫(yī)學(xué)和組織工程、疾病模型、藥物篩選的理想種子細(xì)胞，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。而hiPSC體外培養(yǎng)條件是否合適則是決定其是否具有應(yīng)用前景的前提，因此也是研究者關(guān)注的熱點(diǎn)。
　　hiPSC的培養(yǎng)包括了體細(xì)胞重編程

2、為hiPSC的過(guò)程（稱為hiPSC的誘導(dǎo)培養(yǎng)）和hiPSC的擴(kuò)增培養(yǎng)兩個(gè)過(guò)程?！昂线m”或者“理想”的hiPSC的培養(yǎng)條件不僅要在擴(kuò)增培養(yǎng)時(shí)維持hiPSC的生物學(xué)特性、符合臨床應(yīng)用前景，還包括這種培養(yǎng)條件是否可同時(shí)支持體細(xì)胞重編程。目前主要使用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(Mouse EmbryonicFibroblast，MEF)作為滋養(yǎng)層支持hiPSC的培養(yǎng)，但是這種含有鼠源性細(xì)胞的培養(yǎng)體系含有許多潛在的微生物感染風(fēng)險(xiǎn)，并且不可避免的帶有異源細(xì)

3、胞和蛋白，限制了hiPSC潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。因此，仍有待進(jìn)一步探索“合適”或者“理想”的hiPSC誘導(dǎo)和擴(kuò)增培養(yǎng)條件。我們關(guān)注于用人源性細(xì)胞作為滋養(yǎng)層用于hiPSC的誘導(dǎo)和擴(kuò)增培養(yǎng)。
　　第1章、人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為滋養(yǎng)層培養(yǎng)hiPSC方法的建立和研究
　　人間充質(zhì)干細(xì)胞（human Mesenchymal Stem Cell，hMSC）是一種具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，可以從少量的骨髓或其他許多組織樣本中分離獲得，可

4、在體外擴(kuò)增培養(yǎng)，并具有低免疫原性等特征，已被證實(shí)可以作為滋養(yǎng)層支持hESC的擴(kuò)增培養(yǎng)，因此可能是一種理想的hiPSC培養(yǎng)人源性細(xì)胞滋養(yǎng)層的選擇。
　　我們創(chuàng)新性地建立一種用hMSC作為滋養(yǎng)層培養(yǎng)hiPSC的方法(專利申請(qǐng)?zhí)?201110036898.4)。我們用來(lái)自三個(gè)健康供者（hMSC1，女性，21歲;hMSC2，女性，45歲;hMSC3，男性，39歲）骨髓的hMSC作為滋養(yǎng)層，發(fā)現(xiàn)其均可支持人包皮成纖維細(xì)胞（human for

5、eskin fibroblast，HFF）重編程。HFF轉(zhuǎn)導(dǎo)攜帶有Klf4、Sox2、Oct4和c-Myc轉(zhuǎn)錄因子的逆轉(zhuǎn)錄病毒后，在hMSC滋養(yǎng)層的支持下，約3周以后形成類hESC克隆。這些克隆挑選后可繼續(xù)在hMSC滋養(yǎng)層上擴(kuò)增，形成典型的hESC形態(tài)。
　　我們檢測(cè)了其中兩個(gè)hiPSC克隆的特性，免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示這些在hMSC滋養(yǎng)層上培養(yǎng)的hiPSC表達(dá)未分化hESC特有的表面標(biāo)記，如AP、SSEA-3、SSEA-4、TRA

6、-1-60、TRA-1-81和NANOG; RT-PCR檢測(cè)顯示內(nèi)源性KLF4、SOX2、c-Myc、OCT4在這些hiPSC上均被激活，并表達(dá)NANOG、DNMT3B、 DPPA4、hTERT、NODAL、REX1和TDGF1等多個(gè)多潛能基因;EB分化實(shí)驗(yàn)和畸胎瘤形成實(shí)驗(yàn)顯示其在體內(nèi)外均可形成典型的三胚層組織，具有向三胚層分化的潛能;此外，培養(yǎng)14代以上后，標(biāo)準(zhǔn)G-帶核型分析實(shí)驗(yàn)顯示這兩個(gè)hiPSC克隆的核型均為46，XY，提示hiP

7、SC在hMSC滋養(yǎng)層上擴(kuò)增培養(yǎng)后仍維持正常核型。
　　本研究首次證實(shí)了來(lái)自不同健康供者的hMS可作為滋養(yǎng)層支持人成纖維細(xì)胞的重編程和擴(kuò)增培養(yǎng)獲得的hiPSC，建立了一種hiPSC人源化培養(yǎng)體系，為建立符合臨床應(yīng)用需要的hiPSC的培養(yǎng)方法提供了一種可行途徑。
　　第2章、自身成纖維細(xì)胞作為滋養(yǎng)層培養(yǎng)hiPSC方法的建立和研究
　　我們?cè)谘芯咳顺衫w維細(xì)胞重編程的過(guò)程中觀察到，轉(zhuǎn)導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄病毒后，大部分成纖維細(xì)胞形態(tài)上并沒(méi)有

8、發(fā)生改變，且仍具有較強(qiáng)的增殖能力。而MEF滋養(yǎng)層因滅活處理，喪失增殖能力。在將轉(zhuǎn)導(dǎo)了病毒的成纖維接種到MEF滋養(yǎng)層上一周以后，培養(yǎng)體系中幾乎全部是成纖維細(xì)胞，觀察不到MEF滋養(yǎng)層的存在。我們推測(cè)重編程過(guò)程的后期，可能主要由大部分沒(méi)有發(fā)生重編程的成纖維細(xì)胞支持小部分成纖維細(xì)胞重編程。因此，我們研究了自身成纖維細(xì)胞是否可作為滋養(yǎng)層支持hiPSC的誘導(dǎo)和擴(kuò)增培養(yǎng)，并研究以自身成纖維為滋養(yǎng)層誘導(dǎo)培養(yǎng)的hiPSC的生物學(xué)特征。
　　我們從兩

9、個(gè)需做包皮環(huán)切術(shù)兒童手術(shù)后廢棄的包皮中分離到兩株包皮成纖維細(xì)胞，對(duì)二者均進(jìn)行了相關(guān)研究。將HFF轉(zhuǎn)導(dǎo)攜帶有Klf4、Sox2、Oct4和c-Myc轉(zhuǎn)錄因子的逆轉(zhuǎn)錄病毒后，不再作消化收集，而是在原來(lái)的體系中用hiPSC培養(yǎng)液一直培養(yǎng)。我們觀察到，轉(zhuǎn)導(dǎo)病毒后，大部分的成纖維細(xì)胞形態(tài)上并沒(méi)有發(fā)生改變，且仍具有較強(qiáng)的增殖能力。9-10天后，小部分成纖維細(xì)胞聚集成小簇，細(xì)胞形態(tài)變短變寬，向上皮樣轉(zhuǎn)變，核仁明顯。約3周后，部分小簇形成較大致密的克隆

10、樣細(xì)胞團(tuán)塊。這些克隆挑選后可繼續(xù)在自身HFF滋養(yǎng)層上擴(kuò)增，形成典型的hESC形態(tài)。表明在重編程過(guò)程中，未發(fā)生有效重編程的自身成纖維細(xì)胞可以作為滋養(yǎng)層支持其他成纖維細(xì)胞的重編程。
　　我們主要檢測(cè)了擴(kuò)增后其中一個(gè)克隆的特性，免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示這些在自身HFF滋養(yǎng)層上培養(yǎng)的hiPSC表達(dá)未分化hESC特有的表面標(biāo)記，如SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81和NANOG; RT-PCR檢測(cè)顯示內(nèi)源性KLF4、SOX2、c-M

11、yc、OCT4在這些hiPSC上均被激活，并表達(dá)NANOG、DNMT3B、hTERT、DPPA4和NODAL等多個(gè)多潛能基因;EB分化實(shí)驗(yàn)和畸胎瘤形成實(shí)驗(yàn)顯示其在體內(nèi)外均可形成典型的三胚層組織，具有向三胚層分化的潛能;此外，培養(yǎng)21代以上后，標(biāo)準(zhǔn)G-帶核型分析實(shí)驗(yàn)顯示這兩個(gè)hiPSC克隆的核型均為46，XY，提示hiPSC在自身HFF滋養(yǎng)層上擴(kuò)增培養(yǎng)后仍維持正常核型。
　　本研究首次證實(shí)了轉(zhuǎn)導(dǎo)了攜帶有Klf4、Sox2、Oct4和

12、c-Myc轉(zhuǎn)錄因子的逆轉(zhuǎn)錄病毒后，未發(fā)生重編程的自身HFF可支持小部分HFF發(fā)生重編程。建立了一種用自身HFF支持hiPSC的誘導(dǎo)和擴(kuò)增培養(yǎng)的人源化培養(yǎng)體系，為建立符合臨床應(yīng)用需要的hiPSC的培養(yǎng)方法提供了另一種更具有優(yōu)勢(shì)的可行途徑，也為研究人成纖維細(xì)胞重編程機(jī)制提供了一個(gè)很好的模型。
　　第3章、不同滋養(yǎng)層對(duì)重編程效率和hiPSC自我更新能力、多向分化潛能影響的研究
　　培養(yǎng)微環(huán)境涉及細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞因子等各種成分

13、，通過(guò)多種途徑影響體細(xì)胞重編程和多能干細(xì)胞的生物學(xué)特征。其中滋養(yǎng)層細(xì)胞在培養(yǎng)微環(huán)境中起復(fù)雜而重要的作用。我們?cè)谘芯坑胔MSC和自身HFF作為滋養(yǎng)層支持成纖維細(xì)胞的重編程和培養(yǎng)獲得的hiPSC時(shí)，發(fā)現(xiàn)不同的滋養(yǎng)層對(duì)體細(xì)胞重編程效率和hiPSC自我更新能力、多向分化潛能均具有較明顯的影響。
　　我們比較了不同滋養(yǎng)層對(duì)成纖維細(xì)胞重編程效率的影響。通過(guò)三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)，HFF在以hMSC、自身HFF為滋養(yǎng)層的培養(yǎng)體系中重編程為hiP

14、SC的效率分別是在以MEF為滋養(yǎng)層的培養(yǎng)體系中重編程效率的7.26％±2.09％(P＜0.05)、37.08％±5.63％(P＜0.05)。為了進(jìn)一步明確導(dǎo)致這種差異的原因，我們用MEF條件培養(yǎng)液培養(yǎng)，但是HFF在以hMSC、自身HFF為滋養(yǎng)層的培養(yǎng)體系中重編程為hiPSC的效率并未提高（分別為8.52％±5.4％，35.98％±7.82％），仍然明顯低于其在以MEF為滋養(yǎng)層的培養(yǎng)體系中的重編程效率。
　　此外，我們檢測(cè)了hiPS

15、C克隆在hMSC、HFF、MEF這三種類型滋養(yǎng)層上的增殖情況，發(fā)現(xiàn)其平均擴(kuò)增倍數(shù)分別為2.31±0.12(P＜0.05)、2.66±0.17(P＜0.05)、4.77±0.64。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)以MEF為滋養(yǎng)層培養(yǎng)的hiPSC傳代后培養(yǎng)至第5天時(shí)，大部分克隆仍維持未分化狀態(tài)（未分化克隆占97.3％±1.15％）;至第7天時(shí)，出現(xiàn)小部分分化的克?。ㄎ捶只寺≌?6.7％±6.81％）。而以hMSC、自身HFF為滋養(yǎng)層培養(yǎng)的hiPSC培養(yǎng)至第

16、5天時(shí)，分化的克隆即明顯增多（未分化克隆分別占77.3％±10.1％、80.7％±5.13％，P＜0.05）;至第7天時(shí)，分化的克隆進(jìn)一步增多（未分化克隆分別占64.3％±4.93％、67.3％±6.51％，P＜0.05）。通過(guò)流式檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)在hMSC、自身HFF為滋養(yǎng)層培養(yǎng)7天后的hiPSC克隆中TRA-1-60陽(yáng)性細(xì)胞比例（分別為75.6％±3.35％、74.9％±4.72％）均低于以MEF為滋養(yǎng)層培養(yǎng)的hiPSC克隆中TRA-

17、1-60陽(yáng)性細(xì)胞比例。
　　本研究首次比較了不同滋養(yǎng)層對(duì)人成纖維細(xì)胞重編程效率的影響，發(fā)現(xiàn)在相同條件下，體細(xì)胞在人源性細(xì)胞滋養(yǎng)層上發(fā)生重編程的效率明顯低于其在MEF滋養(yǎng)層上的重編程效率。但是，即使使用了MEF條件培養(yǎng)液，成纖維細(xì)胞在以hMSC、HFF為滋養(yǎng)層的培養(yǎng)體系中重編程為hiPSC的效率并未提高。同樣，用hMSC、HFF作為滋養(yǎng)層培養(yǎng)hiPSC時(shí)，hiPSC的增殖能力明顯低于其在MEF滋養(yǎng)層上的增殖能力，且更易分化。需要進(jìn)一