豬誘導(dǎo)性多潛能干細胞的建立.pdf

1、誘導(dǎo)性多潛能干細胞（iPS細胞）是指通過在分化的體細胞中表達特定的轉(zhuǎn)錄因子來誘導(dǎo)其發(fā)生重編程而獲得的可不斷自我更新和具有多向分化潛能的細胞。iPS細胞技術(shù)的產(chǎn)生和發(fā)展，是干細胞領(lǐng)域乃至整個生物學(xué)領(lǐng)域的一項重大發(fā)現(xiàn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。本研究旨在應(yīng)用限定因子建立豬iPS細胞誘導(dǎo)技術(shù)，為將來深入研究應(yīng)用豬iPS細胞奠定基礎(chǔ)。論文由三個試驗組成，其內(nèi)容如下：
　　 試驗一：攜帶限定因子的慢病毒表達載體的構(gòu)建
　　 以胎豬原始生

2、殖嵴和囊胚為材料，用RT-PCR方法克隆出豬Sox2、Klf4和c-Myc基因的開放閱讀框序列，人OCT4基因序列直接從質(zhì)粒pMX-hOCT4中擴增獲取。經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切，與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLEGFP-N1連接，分別構(gòu)建出限定因子EGFP融合蛋白逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體。再從重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中擴增出CMV啟動子，限定因子和EGFP序列，同時通過酶切從pLL3.7質(zhì)粒中移除U6啟動子、CMV啟動子和EGFP序列，最后把擴增出的CMV啟動子，

3、限定因子和EGFP序列與改造后的pLL3.7進行重組，分別構(gòu)建出限定因子EGFP融合蛋白慢病毒表達載體pLL-hOCT4/pSox2/pKlf4/pMyc-EGFP。重組慢病毒載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞后，在熒光顯微鏡下觀察限定因子表達情況。結(jié)果顯示，豬Sox2、Klf4和c-Myc基因開放閱讀框序列分別與已發(fā)表的豬Sox2、Klf4和c-Myc基因序列高度同源；重組慢病毒載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞后表現(xiàn)為限定因子EGFP融合蛋白定位于細胞

4、核表達，符合限定因子表達特點。這些結(jié)果證實，本試驗的限定因子EGFP融合蛋白慢病毒載體構(gòu)建正確。
　　 試驗二：慢病毒載體法誘導(dǎo)豬iPS細胞
　　 采用組織塊培養(yǎng)法從57d胎齡的杜洛克-長白-大約克三元雜交豬胎兒分離培養(yǎng)建立7株豬胎兒成纖維細胞系。通過磷酸鈣法轉(zhuǎn)染四種限定因子EGFP融合蛋白慢病毒表達載體質(zhì)粒和包裝輔助質(zhì)粒，包裝產(chǎn)生的四種限定因子慢病毒經(jīng)濃縮后感染豬胎兒成纖維細胞，在含1000U/mL LIF和4ng/m

5、L bFGF的干細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)傳代，逐步分離培養(yǎng)出集落邊緣界限清晰的細胞克隆，高倍顯微鏡下集落中的單個細胞呈現(xiàn)細胞核較大，核質(zhì)比例較高。按1∶4比例每3~4d傳代一次，細胞集落生長穩(wěn)定，核型正常，AP檢測為陽性，免疫細胞化學(xué)和RT-PCR檢測有關(guān)鍵性多潛能相關(guān)基因Oct4和Nanog的表達。此外，細胞集落中SSEA-1蛋白表達檢測陽性，SSEA-3/4和TRA-1-61/81檢測陰性。將其注射到BALB/cA裸鼠背側(cè)皮下可

6、形成含有外胚層、中胚層和內(nèi)胚層組織來源的畸胎瘤。以上結(jié)果證實，本試驗所獲得的豬的細胞克隆具有ES細胞樣特征，即成功地從豬胎兒成纖維細胞誘導(dǎo)出iPS細胞。
　　 試驗三：純化蛋白穿膜法誘導(dǎo)豬iPS細胞
　　 由于慢病毒攜帶外源基因的隨機穩(wěn)定整合會帶來潛在的細胞癌化畸變等危害，因此根據(jù)慢病毒介導(dǎo)外源限定因子EGFP融合蛋白的試驗結(jié)果，構(gòu)建攜帶細胞穿膜肽外源限定因子的融合蛋白用于豬iPS細胞的誘導(dǎo)，將會為豬iPS細胞的安全生產(chǎn)

7、、應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。將體外表達、純化的攜帶有細胞穿膜肽——九聚精氨酸(R9)的限定因子-R9融合蛋白添加到培養(yǎng)的豬胎兒成纖維細胞培養(yǎng)液中嘗試建立豬iPS細胞。結(jié)果顯示，在熒光顯微鏡下可觀察到限定因子-R9原核蛋白能進入豬胎兒成纖維細胞，且蛋白能定位于細胞核；在干細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)條件下同時用限定因子-R9原核蛋白處理6個周期后，能逐漸分離培養(yǎng)出集落邊緣界限清晰的細胞克隆，重構(gòu)克隆中的單個細胞呈現(xiàn)細胞核較大，核質(zhì)比例較高，AP為陽性，免疫細胞化學(xué)

8、檢測ES細胞特異性分子標記Oct4和Nanog蛋白表達陽性。這些結(jié)果證實本試驗的限定因子-R9原核蛋白表達載體構(gòu)建正確；細胞穿膜肽R9可轉(zhuǎn)導(dǎo)限定因子重組蛋白進入細胞核；重組限定因子-R9原核蛋白可使豬胎兒成纖維細胞發(fā)生重構(gòu)，且重構(gòu)細胞具有ES細胞樣形態(tài)，可表達AP、Oct4和Nanog蛋白。
　　 綜合以上三個試驗的研究結(jié)果，可以得出如下結(jié)論：
　　 1．運用RT-PCR技術(shù)可以從胎豬的原始生殖嵴和囊胚細胞克隆出豬Sox

9、2、Klf4和c-Myc限定因子基因的開放閱讀框序列；用基因工程技術(shù)將這些限定因子基因序列（包括人Oct4基因序列）與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLEGFP-N1連接，再進行基因重組，能成功地構(gòu)建限定因子EGFP融合蛋白慢病毒表達載體。應(yīng)用這些重組限定因子EGFP融合蛋白可有效追蹤掌握限定因子在細胞重編程過程中的作用機制和特點。
　　 2．用限定因子EGFP融合蛋白慢病毒能誘導(dǎo)豬胎兒成纖維細胞重編程，建立豬iPS細胞。通過限定因子EGFP融

10、合蛋白追蹤發(fā)現(xiàn)，外源限定因子在豬iPS細胞集落中大多數(shù)不表達或低水平表達，少數(shù)細胞高表達，提示體細胞完全重編程形成iPS細胞后外源基因不表達，不完全重編程的體細胞外源基因仍處于高表達狀態(tài)；不同的豬胎兒成纖維細胞可能需要不同的時間去完成重編程進程，或者不同的細胞可能是在不同的時間點上啟動重編程進程。
　　 3．將攜帶有細胞穿膜肽——九聚精氨酸(R9)的限定因子重組蛋白用于豬胎兒成纖維細胞的重編程，獲得了具有ES細胞樣形態(tài)、可表達A