高效制備綿羊誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的研究.pdf

1、綿羊是一種重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)能快速定向選育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的綿羊新品種。然而傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)克隆成功率低，獲得的轉(zhuǎn)基因個(gè)體常存在發(fā)育障礙。基于胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESC）的基因打靶技術(shù)能有效提高獲得轉(zhuǎn)基因小鼠的效率，但迄今為止，真正的綿羊的 ESC很難獲得。利用轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)導(dǎo)綿羊體細(xì)胞建立綿羊的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（sheep induced pluripotent stem cell，siPSC）能代替 E

2、SC進(jìn)行基因打靶制備基因修飾綿羊，但目前制備 siPSC尚處于起步階段，誘導(dǎo)效率非常低。因此，尋找一種高效快速誘導(dǎo) siPSC的方法十分迫切。siPSC的獲得不僅能用于轉(zhuǎn)基因綿羊的制備，還能為綿羊 ESC的培養(yǎng)摸索條件，為探究體細(xì)胞重編程機(jī)制奠定基礎(chǔ)；此外，siPSC在定向分化生殖細(xì)胞等功能細(xì)胞方面也具有廣泛的應(yīng)用前景。
　　目的：（1）分離三種綿羊體細(xì)胞以尋找最佳誘導(dǎo)siPSC的起始細(xì)胞，并制備培養(yǎng)siPSC的飼養(yǎng)層細(xì)胞；（2）

3、構(gòu)建 p53干擾慢病毒質(zhì)粒以提高綿羊體細(xì)胞重編程的效率；（3）構(gòu)建 ASF1A過(guò)表達(dá)的慢病毒質(zhì)粒以提高體綿羊細(xì)胞重編程的效率；（4）高效誘導(dǎo)綿羊體細(xì)胞為 siPSCs；
　　方法：（1）組織塊法分離培養(yǎng)妊娠45 d左右的中國(guó)美利奴綿羊胎兒成纖維細(xì)胞（sheep embryonic fibroblast，SEF）和腎細(xì)胞（sheep kidney cell，SKC），全骨髓法分離培養(yǎng)綿羊胎兒骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow

4、mesenchymal stem cell，BMSC）；胰酶消化法分離孕12.5 d的 CF-1小鼠胎兒成纖維細(xì)胞（mouse embryonic fibroblast，MEF），X-射線輻照處理 P3代的 MEF后凍存，用于培養(yǎng) siPSC；（2）根據(jù) GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中綿羊 p53基因的序列，設(shè)計(jì)干擾 p53的短發(fā)夾 RNA（shRNA），并克隆至慢病毒干擾載體pLenti Lox3.7（pLL3.7），構(gòu)建干擾綿羊 p53基因

5、的慢病毒干擾載體 pLL3.7-p53-shRNA。使用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒 pLL3.7-p53-shRNA和 pLL3.7空載體及輔助質(zhì)粒(VSVG、pMDL和 REV)后在 HEK-293FT細(xì)胞中包裝慢病毒并測(cè)定滴度，以慢病毒 MOI=10感染 SKC后，利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR和 Western blot檢測(cè) p53干擾效率，進(jìn)而篩選干擾效率高的干擾片段用于進(jìn)一步的 siPSC誘導(dǎo)；同時(shí)，使用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR和W

6、estern blot檢測(cè) p21蛋白的表達(dá)情況；（3）根據(jù) GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中綠色熒光蛋白 EGFP和綿羊 ASF1A基因序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增 EGFP和 ASF1A基因的引物序列，分別以 pEGFP-N1和綿羊 cDNA為模板，擴(kuò)增 EGFP和 ASF1A基因，并依次克隆至慢病毒表達(dá)載體pLEX-MCS，構(gòu)建過(guò)表達(dá) ASF1A的慢病毒載體 pLEX-ASF1A-EGFP，并包裝過(guò)表達(dá)ASF1A的慢病毒 ASF1A-LV，使用慢病毒 E

7、GFP-LV作為陰性對(duì)照。于慢病毒感染 SKC后不同時(shí)間段收集細(xì)胞，分別提取細(xì)胞總 RNA和總蛋白，并將總 RNA反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)ASF1A轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達(dá)情況；（4）包裝8種誘導(dǎo) siPSC的慢病毒（Oct4/Sox2/c-Myc/Klf4/Lin28/Nanog/Sv40LT/hTERT），測(cè)定滴度后，分別以慢病毒 MOI=10懸浮感染 SEF、SKC和 BMSC，感染

8、23天后，利用堿性磷酸酶染色比較三種細(xì)胞的重編程效率；選擇重編程效率高的體細(xì)胞，比較添加p53-shRNA和 ASF1A對(duì)重編程效率的影響。所有獲得的 siPSCs進(jìn)行 AP染色、實(shí)時(shí)熒光定量 PCR、免疫熒光染色、甲基化測(cè)序分析、核型分析、擬胚體分化和畸胎瘤形成等方法進(jìn)行鑒定。
　　結(jié)果：（1）成功分離 SKC、SEF、BMSC及 MEF；經(jīng) CD44抗體標(biāo)記鑒定綿羊 BMSC陽(yáng)性率為99.7％；成功制備飼養(yǎng)層細(xì)胞；（2）共設(shè)計(jì)

9、靶向 p53的干擾片段4條，并成功構(gòu)建慢病毒干擾載體；成功包裝 p53干擾慢病毒 p53-shRNA-LV；使用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR和 Western blot成功篩選干擾效率高的干擾片段 p53-shRNA-3；同時(shí)，干擾 p53慢病毒感染 SKC后，p53及其下游靶基因 p21 mRNA和蛋白的表達(dá)水平顯著性降低；（3）成功克隆 EGFP和 ASF1A基因，并成功構(gòu)建 ASF1A過(guò)表達(dá)的慢病毒表達(dá)載體Plex-ASF1A-EGFP；

10、成功包裝 ASF1A過(guò)表達(dá)的慢病毒 ASF1A-LV；ASF1A-LV感染 SKC細(xì)胞后顯著性增加了 ASF1A mRNA和蛋白表達(dá)水平；（4）成功利用8種 siPSC誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)綿羊三種體細(xì)胞為 siPSC，其中 SKC的重編程效率顯著高于 BMSC和 SEF；過(guò)表達(dá) ASF1A和干擾 p53能顯著性增加 siPSC的形成效率；成功獲得 siPSC6株。
　　結(jié)論：（1）成功分離和培養(yǎng)了三種綿羊體細(xì)胞，為后續(xù)建立高效的綿羊誘導(dǎo)多