白內障患者誘導性多能干細胞(iPS)的建立及其定向分化的研究.pdf

1、年齡相關性白內障(age-related cataract，ARC)為全球致盲眼病的主要原因。在我國約有250萬人因白內障致盲，占全球白內障致盲總數(shù)的10％。隨著人口的老齡化，預計我國每年新增白內障患者將超過100萬，而我國的白內障年手術量尚不足以解決每年的新增例數(shù)。因此，我國的白內障盲防治問題十分嚴峻。而先天性白內障是指出生前即存在，或出生后才逐漸形成的先天遺傳或發(fā)育障礙的白內障，超過1/3的患者是遺傳所致。任何參與、影響晶狀體發(fā)育的

2、基因突變都可能導致先天性白內障的發(fā)生。因此，明確先天性白內障的發(fā)病機制對于治療及預防先天性白內障的發(fā)生發(fā)展具有重要的意義。白內障摘除聯(lián)合人工晶狀體(intraocular lens，IOL)植入是目前治療白內障最常用且效果較為理想的方法，而后囊膜混濁(posterior capsular opacification，PCO)是影響病人術后遠期視力預后的最常見的并發(fā)癥，其術后5年的發(fā)生率高達30％左右。雖然可以利用激光或者手術切開混濁的后

3、囊膜，但是卻增加了病人的經(jīng)濟負擔，并會帶來新的并發(fā)癥。所以如何預防PCO的發(fā)生是眼科醫(yī)生和病人都比較關注的一個問題。
　　 體細胞誘導成為多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)的研究成果被國際生命科學界譽為具有里程碑意義的創(chuàng)新之舉。多能干細胞能夠自我更新，能在體內外分化成幾乎所有類型的細胞，在再生醫(yī)學等方面有巨大的應用潛力，具有極高的理論研究價值。通常用來源于囊胚期胚胎的內細胞團的

4、胚胎干細胞、通過核移植得到的胚胎干細胞以及在成體細胞中轉入外源轉錄因子得到的iPSCs，進行體細胞重編程研究。在短短數(shù)年的時間里，此項研究已經(jīng)在細胞重編程的機理研究、探索疾病的發(fā)生發(fā)展機制以及臨床醫(yī)學的應用等領域引發(fā)了很多突破性的進展；而且這一非克隆干細胞技術的誕生，成功地避開了長期以來爭論不休的倫理問題，極大地推動該領域和相關科學領域的發(fā)展。與胚胎干細胞研究相比，體細胞重編程技術可以為更多的患者提供特異性多能干細胞。因而，在醫(yī)學應用方

5、面(例如器官培養(yǎng)和器官移植等)有廣闊的前景。
　　 患者特異性的多能干細胞的建立能夠為疾病發(fā)病機制的研究、治療藥物的篩選及細胞移植治療提供有力的工具。采用慢病毒載體將外源性轉錄因子導入白內障患者晶體上皮細胞，從而獲得誘導性多能干細胞。白內障患者來源的多能干細胞的建立，能夠為晶體發(fā)育、細胞分化、衰老提供便利的細胞模型，同時可為白內障治療藥物的篩選及白內障發(fā)病機制的研究提供有力的研究工具。
　　 第一部分原代人晶體上皮細胞的

6、體外培養(yǎng)
　　 目的:對正常人晶體、年齡相關性白內障晶體上皮細胞及人皮膚成纖維細胞進行體外培養(yǎng)，并觀察體外培養(yǎng)的晶體上皮細胞及皮膚成纖維細胞的生物學特性及組織學變化。
　　 方法:正常人晶體上皮細胞培養(yǎng)取材于角膜移植術后供體眼的晶狀體囊膜，年齡相關性白內障晶體上皮細胞培養(yǎng)取材于白內障超乳手術中撕除的晶體前囊膜。角膜移植術后供體眼的晶狀體沿赤道部后方約2mm環(huán)形剪開后囊膜，小心取下完整的前囊膜和赤道部囊膜，剪成1mm×1m

7、m大小的組織塊，利用組織塊貼片法，進行原代人晶狀體上皮細胞的培養(yǎng)。白內障晶體前囊膜在超乳手術中完整取材、洗去粘彈劑之后剪成1mm×1mm大小的組織塊，利用組織塊貼片法進行培養(yǎng)。使用0.25％胰酶溶液對融合后的細胞進行消化傳代。取年齡相關性白內障患者的皮膚組織，剪成1mm3大小的組織塊，過夜消化，離心收集細胞，經(jīng)多次傳代后，獲得較為純化的皮膚成纖維細胞進行培養(yǎng)。在倒置相差顯微鏡下對三種細胞進行形態(tài)學觀察。采用CCK-8法連續(xù)7天測定三種細

8、胞的增殖速率，繪制生長曲線并進行比較。
　　 結果:正常人晶體囊膜組織塊貼壁48～72小時后可見人晶狀體上皮細胞從組織塊邊緣長出，約10～15天達到融合。初期正常人晶體上皮細胞為多角形，胞體透亮，細胞邊界清晰。融合后的細胞具有上皮細胞的形態(tài)特征，為典型的六角形或多邊形。在體外細胞可傳五代，但第三代以后細胞表型向成纖維細胞轉化。第三代以后正常人晶體上皮細胞胞體呈梭形或長條形。第五代正常人晶體上皮細胞老化，胞漿內出現(xiàn)大小不等的空泡樣

9、改變，最后崩解死亡。白內障患者晶體上皮細胞形態(tài)與增殖能力與正常晶體上皮細胞相類似，但部分白內障晶體上皮細胞與正常人晶體上皮細胞形態(tài)差異較大，更接近成纖維細胞，且細胞在第一次傳代后即老化崩解。人皮膚成纖維細胞伸展呈梭形或多邊形，在經(jīng)過多次培養(yǎng)傳代后，可得到較為純化的成纖維細胞。CCK-8法繪制的生長曲線表明人皮膚成纖維細胞具有最高的增殖速率，白內障患者的晶體上皮細胞增殖最慢。
　　 結論:利用組織塊貼片法進行人晶狀體上皮細胞培養(yǎng)，

10、操作簡單，成功率高。第二代人晶狀體上皮細胞是進行細胞學及相關研究比較理想的實驗對象。正常人晶體上皮細胞具有較好的生長及增殖能力，而白內障晶體上皮細胞增殖力差、細胞形態(tài)不佳。人皮膚成纖維細胞在消化離心后經(jīng)過多次傳代能夠獲得純化的成纖維細胞。人皮膚成纖維細胞增殖最快，正常人晶體上皮細胞增殖速率居中，白內障患者晶體上皮細胞增殖速率最慢。
　　 第二部分白內障患者誘導性多能干細胞的建立
　　 目的:分別構建表達OCT-4、SOX

11、-2和KLF-4的慢病毒載體(Lentivirus)，并轉染年齡相關性白內障患者體外培養(yǎng)的晶體上皮細胞，誘導建立患者來源的誘導性多能干細胞，與同一患者來源的皮膚成纖維細胞對比，觀察限定因子對于誘導多能干細胞的誘導效率。
　　 方法:選擇3例診斷為年齡相關性白內障的患者，取其晶體前囊膜及皮膚組織進行體外培養(yǎng)。白內障晶體前囊膜在超乳手術中完整取材、洗去粘彈劑之后剪成1mm×1mm大小的組織塊，利用組織塊貼片法進行培養(yǎng)。使用0.25％

12、胰酶溶液對融合后的細胞進行消化傳代。取上述3例年齡相關性白內障患者的皮膚組織，剪成1mm3大小的組織塊，過夜消化，離心收集細胞，經(jīng)傳代后，獲得較為純化的皮膚成纖維細胞進行培養(yǎng)。分別將含有OCT-4、SOX-2和KLF-4的慢病毒載體質粒(plenti-hOCT4/plenti-hSOX2/plenti-hKLF4)同輔助質粒(pCMV-gag-pol-PA/pCMV-VSVg)一起共感染293T細胞，重組包裝構建慢病毒載體(分別為Len

13、ti-OCT-4/Lenti-SOX-2/Lenti-KLF-4)。將構建的三種慢病毒載體混合分別感染第2代的白內障晶體上皮細胞和人皮膚成纖維細胞，培養(yǎng)5天后，與小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblasts，MEFs)進行共培養(yǎng)，直至出現(xiàn)iPSCs。采用堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)染色比較白內障晶體上皮細胞和人皮膚成纖維細胞誘導生成iPSCs的效率差異。同時培養(yǎng)人H9胚胎干

14、細胞(embryonic stem cells，ESCs)進行對照。
　　 結果:利用組織塊貼片法培養(yǎng)的白內障患者晶體上皮細胞及消化法培養(yǎng)的人皮膚成纖維細胞形態(tài)與增殖能力較好，第2代細胞適用于進行慢病毒感染。構建的慢病毒載體Lenti-OCT-4/Lenti-SOX-2/Lenti-KLF-4能高效轉染兩種細胞，并不影響細胞的狀態(tài)及增殖能力。在慢病毒載體轉染后第5天，將白內障晶體上皮細胞和人皮膚成纖維細胞分別與MEFs進行共培養(yǎng)

15、，在轉染后第12天開始出現(xiàn)與ESCs形態(tài)相似的細胞克隆。細胞克隆堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)染色陽性，說明已成功誘導出iPSCs。采用AKP染色各比較3例患者的白內障晶體上皮細胞和人皮膚成纖維細胞誘導生成iPSCs的效率差異，在1×106的細胞接種密度下，白內障晶體上皮細胞平均可生成27.7個AKP陽性的細胞克隆，而人皮膚成纖維細胞平均僅生成15個細胞克隆。白內障晶體上皮細胞誘導形成的iPSCs細胞克隆

16、與ESCs在細胞形態(tài)上具有相似性。
　　 結論:構建的慢病毒載體Lenti-OCT-4/Lenti-SOX-2/Lenti-KLF-4能高效轉染白內障晶體上皮細胞和人皮膚成纖維細胞，并成功誘導出與ESCs形態(tài)相似、AKP染色陽性的iPSCs，且白內障晶體上皮細胞與人皮膚成纖維細胞相比具有更高的iPSCs誘導效率。
　　 第三部分白內障患者誘導性多能干細胞的鑒定
　　 目的:對誘導建立的白內障患者來源的誘導性多能干

17、細胞(iPSCs)進行鑒定，檢測細胞的分子標記及體內外分化能力，評價其多能性。
　　 方法:對已成功誘導的白內障患者來源的iPSCs進行多能性鑒定：基因表達、免疫熒光染色分析、RT-PCR檢測、體外分化擬胚體、體內分化畸胎瘤檢測。提取iPSCs、ESCs和白內障患者晶體上皮細胞的總RNA采用HG-U133-2 array(Affymetrix)對三種細胞的全基因表達譜進行檢測并進行對比。提取iPSCs、ESCs和白內障患者晶體上

18、皮細胞的總RNA，RT-PCR檢測人ESCs標志性基因(Nanog、OCT-4、REX-1、SOX-2、VIMENTIN)表達。采用細胞免疫組化熒光(immunohistochemistry，ICH)檢測人ESCs標志性抗原(SSEA-3、SSEA-4、Nanog、TRA-60、TRA-81、OCT-4)的表達。將iPSCs懸浮培養(yǎng)觀察擬胚體(embryoid body，EB)形成，并在培養(yǎng)基中添加特殊成分(BMP4，F(xiàn)BS，retin

19、oic acid(RA))觀察EB的體外分化。將iPSCs接種至裸鼠皮下，觀察畸胎瘤形成及體內分化情況。
　　 結果:基因表達譜的分析結果顯示，iPSCs與ESCs的基因表達譜極為相似，但與白內障患者晶體上皮細胞的基因表達譜有較大差異。我們選擇了1例56歲的年齡相關性白內障患者的iPSCs，并隨機選擇其中4個細胞克隆(分別命名為iPS1、iPS2、iPS3、iPS4)進行檢測。RT-PCR檢測的結果顯示，iPS1與ESCs的ES

20、Cs標志性基因Nanog、OCT-4、REX-1、SOX-2和VIMENTIN的表達最為相似，而其他3株克隆與ESCs存在一定的差異。對iPS1進行ICH檢測顯示，人ESCs標志性抗原(SSEA-3、SSEA-4、Nanog、TRA-60、TRA-81、OCT-4)在iPS1中明顯表達。體外分化擬胚體的結果顯示，EB的分化使得Nanog和OCT-4表達下調，培養(yǎng)基中分別添加BMP4、FBS、RA之后，外胚層標志性基因NACM、TH和GF

21、AP/內胚層標志性基因amylase、SOX7和AFP/中胚層標志性基因PECAM、desmin和SCL在EB中的表達均出現(xiàn)了不同程度的上調表達。對EB細胞進行ICH檢測結果顯示，EB細胞表達中胚層標志物α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、外胚層標志物β-微管蛋白(tubulin beta1，Tuj-1)和內胚層標志物甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)。體內分化畸胎瘤的結果顯示，裸鼠

22、注射iPSCs1個月左右可在裸鼠注射部位見腫塊形成，2個月后摘除腫瘤進行組織切片檢查，鏡下可見三個胚層的組織細胞。
　　 結論:研究誘導的iPSCs在基因表達譜、ICH、RT-PCR檢測、體內外分化能力方面與ESCs極為相似，建立的iPSCs具有與ESCs相同的多向分化能力。
　　 第四部分白內障患者誘導性多能干細胞向晶體前體細胞的分化誘導
　　 目的:探討利用誘導因子三步法將白內障患者來源的多能干細胞誘導為晶體

23、前體細胞的方法，評價分化細胞與晶體細胞的相似性。
　　 方法:對已成功誘導的白內障患者晶體上皮細胞來源的iPSCs及ESCs進行三步法的分化誘導：在細胞培養(yǎng)基中添加(1)第0～5天100 ng/ml Noggin；(2)第5～15天100 ng/ml bFGF、20 ng/ml BMP4和20 ng/ml BMP7；(3)第15～30天100ng/ml FGF2和20 ng/ml Wnt-3a。每5天提取iPSCs和ESCs的R

24、NA，RT-PCR檢測晶體細胞分化標志基因PAX6、SOX2、SIX3、CRYAB、CRYAA、BFSP1和MIP表達情況，并繪制變化曲線。采用ICH檢測分化過程中晶體細胞分化標志PAX6、α-晶體蛋白和β-晶體蛋白的表達。提取iPSCs、ESCs和人晶體的總蛋白，Western-blot法檢測晶體細胞分化標志PAX6、α-晶體蛋白和β-晶體蛋白的表達水平并進行比較。取3例人晶狀體，分別為22歲、44歲和65歲，提取總蛋白，并提取白內障

25、患者晶體上皮細胞來源的iPSCs、人皮膚成纖維細胞來源的iPSCs及ESCs的總蛋白，Western-blot法檢測間隙連接蛋白43(connexin43)和纖維連接蛋白(fibronectin)，以評價其上皮-間質轉化(epithelial mesenchymaltransitions，EMT)的程度。
　　 結果:經(jīng)過三階段誘導因子的作用后，對發(fā)生分化的iPSCs和ESCs進行的RT-PCR檢測顯示，PAX6、CRYAB、C

26、RYAA、BFSP1和MIP的表達持續(xù)上升，SOX2的表達持續(xù)下降，SIX3的表達則是先上升后下降。ICH檢測的結果顯示分化過程中，iPSCs出現(xiàn)了晶體細胞分化標志PAX6、α-晶體蛋白和β-晶體蛋白的持續(xù)表達。Western-blot的結果顯示，iPSCs、ESCs和人晶體中均有PAX6、α-晶體蛋白和β-晶體蛋白的表達，但ESCs的蛋白表達水平相對較低。EMT評價的結果顯示，connexin43在22歲晶體中表達量最高，隨著年齡的增

27、加而明顯降低，fibronectin則隨著年齡的增加表達量逐漸增高；而在白內障患者晶體上皮細胞來源、人皮膚成纖維細胞的iPSCs及ESCs誘導分化的細胞中，connexin43在白內障患者來源的細胞中表達量最高，而fibronectin的表達相似。
　　 結論:三階段誘導因子的組合作用能夠成功誘導出晶體前體細胞，且誘導分化的細胞能夠穩(wěn)定表達晶體細胞的標志性基因及蛋白。白內障患者晶體上皮細胞來源的iPSCs相比人皮膚成纖維細胞來源