人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的基礎(chǔ)研究.pdf

1、【背景與目的】誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells,iPS細(xì)胞)是一種具有類似胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cell,ES細(xì)胞)特性和功能的多能干細(xì)胞。iPS細(xì)胞來源于自體細(xì)胞,具有低免疫原性,且不受倫理問題的制約,因此,其被越來越廣泛的應(yīng)用于細(xì)胞替代治療、疾病機(jī)理及藥物篩選研究。盡管如此,尋找更合適的ips細(xì)胞來源及安全有效的誘導(dǎo)方案是急需解決的問題。我們的前期研究表明,人臍帶間充質(zhì)

2、干細(xì)胞(HUMSCs)自身表達(dá)iPS所需部分相關(guān)基因且具有一定的多能性。因此,HUMSCs有可能作為產(chǎn)生iPS細(xì)胞的理想來源。本項(xiàng)目旨在探討HUMSCs來源iPS細(xì)胞(HUMSC-iPS)的生物學(xué)特性及其誘導(dǎo)效率,并建立一套安全而高效的HUMSC-iPS培養(yǎng)途徑,從而為進(jìn)一步探討HUMSC-iPS的形成機(jī)制和分化能力奠定基礎(chǔ)。
　　【材料與方法】
　　(1)采用差異貼壁法分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增出人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞;
　　(2

3、)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、測(cè)序并擴(kuò)增;
　　(3)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,包裝出重組慢病毒液;
　　(4)倒置顯微鏡測(cè)定凍存前后病毒液滴度;
　　(5)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)病毒感染力;
　　(6)RT-PCR、熒光定量PCR檢測(cè)感染后HUMSCs內(nèi)基因表達(dá)情況;
　　(7)組織貼壁法原代培養(yǎng)胎鼠成纖維細(xì)胞(MEF)及制作MEF飼養(yǎng)層;
　　(8)分別攜帶轉(zhuǎn)錄因子(Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc)的重組慢病毒載體

4、同時(shí)感染HUMSCs,嘌呤霉素篩選后,消化鋪入飼養(yǎng)層,觀察克隆的形成。
　　【結(jié)果】
　　(1)質(zhì)粒測(cè)序、驗(yàn)證正確;
　　(2)制備的新鮮病毒液滴度達(dá)5×108u/ml,凍存后降為5×106u/ml;
　　(3)新鮮的重組慢病毒對(duì)于HUMSCs的感染力高于80％;
　　(4)感染后HUMSCs內(nèi)Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc基因的表達(dá)量明顯升高,p<0.05;
　　(5)在四基因轉(zhuǎn)入HUMS