應用磁性納米顆粒介導人源化轉(zhuǎn)錄因子重組蛋白重編程廣西巴馬小型豬耳成纖維細胞為誘導性多能干細胞(iPSCs)的研究.pdf

1、誘導性多能干細胞（Induced pluripotent stemcells,iPSCs）來源于體細胞的重編程，與胚胎干細胞（Embryonic Stem Cells,ESCs）相比具有很大的優(yōu)越性：無需破壞胚胎，可完全避免倫理之爭。然而，截至目前，iPSCs的研究尚存在幾大難題：1）安全性差；2）效率低；3）耗時長。鑒于此，本研究引入了磁性納米技術，旨在建立一種安全性高、效率可觀、耗時較短的獲取iPSCs的新方法。首先，將四個人源化轉(zhuǎn)

2、錄因子基因（Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc）分別整合入四個pEGFP-N1載體，形成四種重組質(zhì)粒，然后利用聚乙烯亞胺（Po lyether imid e,PEI）表面修飾后的磁性納米顆粒（Poly-MAG）與其偶聯(lián)，轉(zhuǎn)染293T細胞，以表達四個重組蛋白，再通過G418篩選陽性克隆并增殖培養(yǎng)，然后提取于純化陽性細胞內(nèi)表達的重組蛋白。并再次利用 Poly-MAG與這些重組蛋白結合，提高其導入體細胞的效率，在這些重組蛋白進入廣西巴馬

3、小型豬耳成纖維細胞以后發(fā)揮重編程逆轉(zhuǎn)化的作用，以獲得iPSCs。應用此方法可以避免因病毒轉(zhuǎn)染以及引入外源基因而導致的致瘤風險。與單純利用細胞穿膜肽（Cell penetrating peptides,CPPs）技術介導重組蛋白進入被誘導體細胞發(fā)生重編程的方法相比較，應用與磁性納米技術相結合誘導出現(xiàn)iPSCs的時間更短、效率更高。主要研究結果如下：
　　試驗一：廣西巴馬小型豬皮膚成纖維細胞的分離方法及培養(yǎng)體系優(yōu)化
　　為了挑選

4、生長性能良好的廣西巴馬小型豬皮膚成纖維細胞作為靶細胞進行重編程逆轉(zhuǎn)化試驗，本研究采用5種不同方法（4種酶消化法和1種組織塊培養(yǎng)法）分離成纖維細胞，通過比較細胞數(shù)和細胞死亡率，篩選出適宜的分離方法，并比較了小型豬不同部位（耳部、腿部、腹部、背部和尾部）皮膚組織獲取成纖維細胞的差異性。結果表明：
　?。?）采用先加0.25％胰蛋白酶消化30min，再加0.2%膠原蛋白酶消化30min的方法所獲成纖維細胞數(shù)量顯著高于其他處理組（p＜0.

5、05），死亡率與0.125%胰酶消化60min處理組之間差異不顯著（p＞0.05），但顯著低于其他酶消化處理組（p＜0.05）；
　?。?）利用組織塊培養(yǎng)法，4天后即可從組織塊邊緣長出成纖維細胞，去除組織塊后，經(jīng)過5天，細胞匯合率可達80%，與酶消化法（細胞匯合率達80%僅耗時2天）相比，耗時更長；
　　（3）五個不同部位皮膚中，以耳部皮膚獲得細胞數(shù)最多，培養(yǎng)后貼壁效果最好；
　?。?）所得耳皮膚成纖維細胞可傳至10代

6、以上，其中第3代和第4代細胞的活力最強；
　?。?）豬耳成纖維細胞生長曲線顯示，細胞在接種培養(yǎng)后的0~3d內(nèi)處于生長潛伏期，而在3~8d內(nèi)細胞呈對數(shù)生長，8d后細胞進入生長平臺期，10d后細胞貼壁能力下降，呈現(xiàn)負增長。因此，宜選用0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化30min，再加0.2%膠原蛋白酶消化30min的方法分離豬耳皮膚成纖維細胞，取培養(yǎng)3~8d的第3代或第4代細胞進行后續(xù)重編程試驗。
　　試驗二：三種轉(zhuǎn)染試

7、劑介導重組質(zhì)粒DNA進入293T細胞的條件優(yōu)化
　　本試驗旨在探討脂質(zhì)體2000（Lipofectamine?2000）、PEI和Poly-MAG這三種轉(zhuǎn)染試劑在結合含Oct4基因的pEGFP-N1質(zhì)粒后向293T細胞內(nèi)轉(zhuǎn)導的效率差異性。試驗先將所提質(zhì)粒進行濃度測定及瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后，分別采用不同濃度的上述三種轉(zhuǎn)染試劑與不同濃度的重組有Oct4基因的pEGFP-N1偶聯(lián)，轉(zhuǎn)染293T細胞，以pEGFP-N1載體自帶的綠色熒

8、光蛋白（Green Fluorescent Protein,GFP）基因做報告基因，通過統(tǒng)計各個濃度的轉(zhuǎn)染效率及細胞存活率，篩選出轉(zhuǎn)染效率高、細胞毒性小的一種轉(zhuǎn)染試劑及其最佳工作濃度。最后通過G418對轉(zhuǎn)染后的293T細胞進行陽性克隆篩選，經(jīng)增殖培養(yǎng)后提取和純化重組蛋白，測定其濃度，并通過SDS-PAGE檢測其純度。本試驗還采用普魯士藍染色法對293T細胞內(nèi)的磁性氧化鐵納米顆粒進行了定性檢測。結果表明：
　?。?）四個轉(zhuǎn)錄因子基因

9、（Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc）重組質(zhì)粒濃度分別為：（299ng/μL、492ng/μL、500ng/μL和481ng/μL），DNA電泳條帶全部吻合，且純度高。
　?。?）Poly-MAG、Lipofectamine?2000、PEI三種轉(zhuǎn)染試劑介導含Oct4的重組質(zhì)粒進入293T細胞的適宜濃度分別為：10μg/mL（磁板作用20min）、5μg/mL和40μg/mL，其轉(zhuǎn)染效率分別為64.09±0.53%、63.8

10、2±2.53%和30.20±2.28%。Poly-MAG（10μg/mL，磁板作用20min）處理組的細胞存活率極顯著高于PEI（40μg/mL）處理組和Lipofectamine?2000（5μg/mL）處理組，（91.75±0.62%vs60.40±3.66%，31.10±5.58%，p<0.01）。
　?。?）在陽性克隆的篩選試驗中，當G418濃度600μg/mL和700μg/mL時，陽性克隆率分別為（86.54±2.35%

11、vs90.00±1.49%），二者差異不顯著，但均顯著高于其他處理組，（p<0.05）。
　　（4）四種重組蛋白（Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc）純化后濃度分別為：（461μg/mL，434μg/mL，615μg/mL，787μg/mL），通過SDS-PAGE檢測，可見目的蛋白條帶清晰，純度高。
　?。?）在普魯士藍染色試驗中，10μg/mL Poly-MAG處理組中有80%以上的293T細胞可被染成藍色。

12、　　綜上所述，宜選用10μg/mL Poly-MAG于磁板上作用20min的方法對293T細胞進行轉(zhuǎn)染，有80%以上的細胞普魯士藍染色呈陽性反應，表明這些細胞內(nèi)存在磁性氧化鐵納米顆粒。使用含600μg/mL或700μg/mL G418的細胞培養(yǎng)液對轉(zhuǎn)染后的293T細胞進行篩選后GFP陽性克隆率最高（86.54±2.35%vs90.00±1.49%）。重組蛋白提取純化后經(jīng)濃度和純度檢測，顯示四個蛋白均符合后續(xù)試驗要求。
　　試驗三：

13、應用磁性納米技術介導人源化轉(zhuǎn)錄因子重組蛋白重編程廣西巴馬小型豬耳皮膚成纖維細胞成為誘導性多能干細胞的可行性研究
　　本試驗旨在探討磁性納米顆粒與轉(zhuǎn)錄因子重組蛋白的偶聯(lián)效果及其在縮短重組蛋白介導體細胞重編程時間上的可能性。本試驗利用磁性納米顆粒介導四種轉(zhuǎn)錄因子的重組蛋白進入廣西巴馬小型豬皮膚成纖維細胞，使其發(fā)生重編程，并以單純使用四種轉(zhuǎn)錄因子的重組蛋白（內(nèi)含9R聚精氨酸）處理豬皮膚成纖維細胞作為對照，試驗中采用重組蛋白循環(huán)處理法，以

14、便為成纖維細胞提供持續(xù)的重編程“能量”。為探究所得iPSCs樣克隆的多能性，本試驗采用形態(tài)學觀察法，堿性磷酸酶（Alkline phosphatase，AKP）染色及Oct4免疫組織化學染色法對其進行鑒定。結果顯示：
　　使用磁性納米顆粒偶聯(lián)四種轉(zhuǎn)錄因子重組蛋白介導體細胞重編程獲得的iPSCs克隆數(shù)（86個）顯著高于單純利用含細胞穿膜肽的轉(zhuǎn)錄因子重組蛋白介導體細胞重編程所獲iPSCs克隆數(shù)（54個，P＜0.05）；從形態(tài)上看，所形

15、成的細胞克隆緊密吸附于小鼠胚胎成纖維細胞（Mouse embryonal fibroblast cells，MEFs）飼養(yǎng)層上，形似“島嶼”狀，且與周圍飼養(yǎng)層細胞分界清楚，高倍鏡下可見細胞克隆的核大而質(zhì)少，細胞間距非常緊密，與 ESCs相似。細胞克隆經(jīng) AKP染液作用后，被染為紅棕色；Oc t4免疫細胞化學染色后呈紅色，為陽性反應，表明所獲得的iPSCs樣克隆具有一定的多能性。此外，在重編程時間上，單純利用含細胞穿膜肽的轉(zhuǎn)錄因子重組蛋白

16、介導體細胞重編程至少需要7周以上才可形成iPSCs，使用磁性納米顆粒偶聯(lián)四種轉(zhuǎn)錄因子重組蛋白獲得iPSCs只需要5周。結果表明，應用磁性納米顆粒不僅可以適當提高重編程效率，而且還能縮短重編程的時間。
　　試驗四：含磁性納米顆粒iPSCs的定位富集試驗
　　本實驗旨在驗證：（1）磁性氧化鐵納米顆粒是否存在于 iPSCs內(nèi)；（2）在磁吸作用下，含有磁性氧化鐵納米顆粒的iPSCs是否具有定位富集的能力。本研究對iPSCs集落進行了

17、普魯士藍染色，觀察其顏色變化；并采用外加磁場對培養(yǎng)有 iPSCs培養(yǎng)瓶的下端進行吸引，檢測iPSCs在瓶內(nèi)的分布情況。結果顯示：IPSCs能夠被普魯士藍染成藍色，且在外加磁場下可以發(fā)生富集現(xiàn)象，證明其內(nèi)存在有磁性氧化鐵納米顆粒。
　　結論：在小型豬皮膚成纖維細胞的獲取中，采用0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA先作用30min+再加0.2%膠原酶作用30min的聯(lián)合消化法獲取耳部皮膚成纖維細胞較好；借助外加磁場，利用表面修飾的磁