miRNA-375在胃癌中的功能及作用機(jī)制.pdf

1、miRNA是新發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性表達(dá)的單鏈短序列小RNA，長(zhǎng)度約19～25個(gè)核苷酸序列，不編碼蛋白質(zhì)，廣泛存在于真核細(xì)胞中，在進(jìn)化上具有保守性。miRNAs通常與靶mRNA的3’非編碼區(qū)(3’-untranslated region，3’-UTR)不完全互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，引起靶mRNA的降解，在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)。大量研究表明miRNA可以對(duì)多種細(xì)胞生物學(xué)行為發(fā)揮重要的調(diào)控作用，包括個(gè)體的發(fā)育、細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等。研究發(fā)

2、現(xiàn)miRNA與多種疾病的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)，包括腫瘤。在腫瘤中，miRNA可能發(fā)揮腫瘤抑制因子的作用，也可能發(fā)揮癌基因的作用。已有大量研究提示miRNA在很多實(shí)體瘤及血液系統(tǒng)腫瘤中異常表達(dá)。為了進(jìn)一步認(rèn)識(shí)miRNA的分子機(jī)理，科學(xué)家們也將研究的內(nèi)容進(jìn)一步擴(kuò)展到對(duì)miRNA下游靶點(diǎn)的研究。由于一個(gè)miRNA可能擁有大量的下游靶點(diǎn)，一個(gè)靶點(diǎn)也可能受多個(gè)上游miRNA的調(diào)控，在腫瘤miRNA表達(dá)譜研究的基礎(chǔ)上精確闡明單個(gè)miRNA的作用及其分子

3、機(jī)理是當(dāng)務(wù)之急，也是腫瘤miRNA分子靶向治療的研究關(guān)鍵。雖然目前miRNA與胃癌的相關(guān)性在逐漸受到關(guān)注，但這方面的研究仍滯后于miRNA與其他常見(jiàn)腫瘤的相關(guān)研究。中國(guó)是胃癌的高發(fā)國(guó)家，據(jù)世界權(quán)威專家估計(jì)，全世界每年新發(fā)生的胃癌為75.5萬(wàn)例，其中約35％發(fā)生在中國(guó)。我國(guó)胃癌發(fā)病率和死亡率在世界上都處于較高水平。雖然目前采取了包括手術(shù)、化療以及其他綜合性治療措施，胃癌的治療效果仍不是十分理想，五年生存率低下。而且我們對(duì)于胃癌的發(fā)病機(jī)理尚

4、缺乏更全面和深入的了解，臨床上也缺乏特異性的胃癌腫瘤標(biāo)記物。因此，深入研究胃癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找新的生物標(biāo)記物和治療靶標(biāo)，提高胃癌的早期診斷率和臨床預(yù)后都迫在眉睫。
　　 目的：采用生物芯片技術(shù)初步篩選在胃癌組織與遠(yuǎn)端非腫瘤組織中表達(dá)具有顯著性差異的miRNAs，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)其中改變最顯著的miR-375進(jìn)行臨床樣本驗(yàn)證。然后通過(guò)建立體外細(xì)胞模型和裸鼠體內(nèi)腫瘤模型研究miR-375對(duì)胃癌細(xì)胞多種生物學(xué)行為的影響，并

5、利用預(yù)測(cè)軟件尋找miR-375的上游調(diào)控因子和下游靶基因，闡明其在胃癌中發(fā)揮作用的可能分子機(jī)理。本課題的研究成果將加深我們對(duì)胃癌發(fā)病的分子機(jī)理的了解，為胃癌的早期診斷和治療提供新的線索，同時(shí)為相關(guān)的新藥開(kāi)發(fā)提供重要的分子靶點(diǎn)。
　　 方法：⑴購(gòu)買胃正常上皮來(lái)源細(xì)胞株GES-1和胃癌細(xì)胞株AGS、MGC-803、HGC-27、BGC-823和SGC-7901。在胃癌手術(shù)過(guò)程中收集胃癌組織及其配對(duì)的遠(yuǎn)端非腫瘤胃組織；在胃鏡室收集胃癌

6、粘膜組織和非腫瘤胃粘膜組織。標(biāo)本收集后分為兩份，一份迅速保存在液氮中備用，另一份進(jìn)行病理檢查。⑵采用生物芯片初步篩選在胃癌組織中表達(dá)明顯改變的miRNAs。再采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)在臨床胃癌標(biāo)本和胃癌細(xì)胞中對(duì)其中改變最為明顯的miR-375進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證。分析利用miR-375表達(dá)水平來(lái)區(qū)分正常胃組織和胃癌組織的特異性和敏感性以及miR-375的表達(dá)水平與胃癌樣本各臨床參數(shù)之間的相關(guān)性。⑶通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-375的前體小分子增加胃癌細(xì)胞中m

7、iR-375的表達(dá)水平，綜合應(yīng)用各種分子細(xì)胞生物學(xué)和現(xiàn)代顯微成像技術(shù)，觀察胃癌細(xì)胞的增殖(細(xì)胞計(jì)數(shù)法、MTT法)、遷移(Transwell方法、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn))和侵襲(Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn))等生物學(xué)行為的變化。⑷建立裸鼠皮下移植瘤模型。裸鼠腋下皮下注射胃癌細(xì)胞，待肉眼可見(jiàn)的瘤體長(zhǎng)出時(shí)，隔天測(cè)量瘤體大小(最大和最小直徑)。當(dāng)瘤體最大直徑到達(dá)20mm時(shí)頸椎脫臼處死裸鼠，剝離移植瘤組織，稱量瘤體重量，繪制生長(zhǎng)曲線。⑸利用miRanda，Ta

8、rgetScan，和PicTar三個(gè)預(yù)測(cè)軟件，綜合分析相關(guān)因素，篩選出miR-375可能的下游靶點(diǎn)Jak2。利用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-375對(duì)靶Jak2的負(fù)調(diào)控作用。在胃癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-375后利用蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)靶Jak2蛋白水平的改變。另外檢測(cè)胃癌手術(shù)樣本中的Jak2蛋白水平，并對(duì)其和miR-375的表達(dá)水平作相關(guān)性分析。利用RNAi技術(shù)降低胃癌細(xì)胞中Jak2的蛋白表達(dá)水平，綜合應(yīng)用各種分子細(xì)胞生物學(xué)和現(xiàn)代顯微成像

9、技術(shù)，觀察胃癌細(xì)胞的增殖(細(xì)胞計(jì)數(shù)法、MTT法)、遷移(Tanswell方法、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn))和侵襲(Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn))等生物學(xué)行為的變化。再利用過(guò)表達(dá)Jak2的拯救實(shí)驗(yàn)觀察被miR-375抑制的細(xì)胞表型能否被Jak2部分或完全逆轉(zhuǎn)。⑹尋找包含miR-375啟動(dòng)子的基因組序列，軟件預(yù)測(cè)可能與之結(jié)合的上游轉(zhuǎn)錄因子，改變細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平后檢測(cè)miR-375表達(dá)水平的改變。利用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子對(duì)miR-375啟動(dòng)

10、子序列轉(zhuǎn)錄活性的影響。利用實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測(cè)胃癌樣本中轉(zhuǎn)錄因子mRNA的水平，并對(duì)其與miR-375的表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　 結(jié)果：①miR-375在胃癌組織和胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平顯著下調(diào)。miR-375的表達(dá)水平區(qū)分胃癌組織和胃非腫瘤組織具有較高的特異性(82.4％)和敏感性(88.2％)。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示miR-375的表達(dá)水平與各臨床病理特征之間不存在顯著相關(guān)性。②外源性過(guò)表達(dá)miR-375能顯著抑制胃癌細(xì)胞

11、的增殖、遷移、侵襲以及瘤體的生長(zhǎng)。③Jak2可能是miR-375的下游靶點(diǎn)，其在胃癌組織中表達(dá)增高，且過(guò)表達(dá)miR-375能顯著降低Jak2的蛋白水平，二者在胃癌組織中的表達(dá)水平呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性。④降低Jak2表達(dá)水平后對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制效果與過(guò)表達(dá)miR-375相似，且在過(guò)表達(dá)miR-375的基礎(chǔ)上再過(guò)量表達(dá)Jak2能部分或完全逆轉(zhuǎn)miR-375對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用。⑤miR-375在胃癌中的表達(dá)可能受到上游

12、轉(zhuǎn)錄因子Snail的負(fù)調(diào)控。
　　 結(jié)論：⑴miR-375在胃癌組織中的表達(dá)呈顯著下調(diào)趨勢(shì)，可能是因?yàn)槭艿皆谖赴┲斜磉_(dá)上調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子Snail的負(fù)調(diào)控，提示miR-375可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到抑癌基因的作用。⑵過(guò)量表達(dá)miR-375或降低Jak2的表達(dá)均能顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，miR-375過(guò)表達(dá)產(chǎn)生的抑制作用還能被其可能的下游靶點(diǎn)Jak2逆轉(zhuǎn)，提示miR-375可能通過(guò)調(diào)控Jak2的表達(dá)來(lái)參與胃癌的發(fā)生發(fā)