miR-31抑制胃癌轉(zhuǎn)移功能及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　miR-31定位在9p21.3,在不同腫瘤中的表達(dá)有非常明顯的差異,但其參與腫瘤的生物學(xué)功能尚未得到很好闡明。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn),miR-31在乳腺癌細(xì)胞中相對(duì)低表達(dá),且與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移相關(guān)。進(jìn)一步的研究揭示其可能通過作用于ITGA5、RDX和RhoA等靶分子抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移。我們先前在對(duì)胃遠(yuǎn)端腺癌組織miRNA表達(dá)譜進(jìn)行基因芯片研究,發(fā)現(xiàn)miR-31在遠(yuǎn)端胃腺癌組織中呈明顯低表達(dá)。初步的細(xì)胞學(xué)研究發(fā)現(xiàn),增加胃

2、癌細(xì)胞中miR-31的表達(dá),可抑制腫瘤細(xì)胞的移動(dòng)能力,提示其可能參與了胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程。所以,在以往工作的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步深入研究miR-31在胃癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移過程中的作用及機(jī)制,將有助于揭示miR-31在腫瘤中的生物學(xué)功能和胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。
　　目的:
　　1.檢測(cè)miR-31在人胃癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)狀況并分析其與胃癌臨床病理因素的相關(guān)性;
　　2.以胃癌細(xì)胞系SGC-7901和 BGC-823為模型,

3、通過體外實(shí)驗(yàn)研究miR-31表達(dá)改變對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和粘附等功能的影響;
　　3.利用miRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件,預(yù)測(cè)并鑒定可能參與miR-31功能的靶基因。
　　方法:
　　1.檢測(cè)miR-31在胃癌組織及細(xì)胞中的表達(dá):選取我院普通外科手術(shù)胃癌組織20例,通過實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法檢測(cè)miR-31在其中的表達(dá)情況,并選取其癌旁組織作為對(duì)照;通過非參數(shù)檢驗(yàn),分析miR-31的表達(dá)豐度與胃癌患者年齡、性別、腫瘤

4、大小、組織學(xué)分型及 TNM分期的相關(guān)性。以人胃粘膜上皮細(xì)胞GES-1為對(duì)照,通過實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法檢測(cè)miR-31在人胃癌細(xì)胞系SGC-7901及BGC-823中的表達(dá)狀況。
　　2.MiR-31對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響:利用細(xì)胞凋亡檢測(cè)、細(xì)胞平板克隆實(shí)驗(yàn)、侵襲遷移實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn),研究 miR-31表達(dá)改變對(duì)胃癌SGC-7901及BGC-823細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、移動(dòng)和粘附功能的影響。
　　3.

5、MiR-31靶基因的預(yù)測(cè):通過 PicTar, TargetScan和 miRDB等常用miRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件,共同預(yù)測(cè)出miR-31作用的重要靶基因;并在文獻(xiàn)回顧的基礎(chǔ)上篩選出與胃腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系密切的基因,并進(jìn)行 Western-Blot驗(yàn)證。
　　結(jié)果:
　　1.實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-31在胃癌組織中的表達(dá)豐度明顯低于其配對(duì)的癌旁組織(P<0.05);與癌旁組織相比較,平均下調(diào)至0.41倍。統(tǒng)計(jì)

6、學(xué)分析發(fā)現(xiàn)胃癌組織中miR-31的表達(dá)與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)(P<0.01),T、N分期越差,miR-31表達(dá)也隨之降低(P<0.05),而與胃癌患者的年齡、性別、腫瘤大小、組織學(xué)分型無明顯相關(guān)性(P>0.05);miR-31在胃癌細(xì)胞系SGC-7901及BGC-823中的表達(dá)均較人胃粘膜上皮細(xì)胞系GES-1明顯降低(P<0.05)。
　　2.通過脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù),上調(diào)胃癌SGC-7901及BGC-823細(xì)胞中miR-31的

7、表達(dá),并通過RT-PCR檢測(cè)證實(shí)轉(zhuǎn)染成功;細(xì)胞凋亡檢測(cè)及細(xì)胞平板克隆實(shí)驗(yàn)提示,增加胃癌細(xì)胞中miR-31的表達(dá),腫瘤細(xì)胞的凋亡及克隆形成能力無明顯變化。侵襲遷移實(shí)驗(yàn)提示,增加胃癌細(xì)胞中miR-31的表達(dá),可明顯抑制 BGC-823細(xì)胞的侵襲及遷移能力;細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)提示,增加胃癌SGC-7901細(xì)胞中miR-31的表達(dá),可明顯抑制細(xì)胞的移動(dòng)能力;細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)提示,增加胃癌SGC-7901細(xì)胞中miR-31的表達(dá),其細(xì)胞粘附率明顯下降。

8、r>　　3.通過 PicTar, TargetScan和 miRDB等軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn) AKAP7、APBB2、CTNND2、HIAT1、HIF1AN、JAZF1、KHDRBS3、MAP4K5、PEX5、PPP2R2A、RGS4、RHOA、RSBN1、SEPHS1、SH2D1A、SLC6A6、SNX4、 STX12、TACC1、TACC2、YWHAE等21個(gè)分子為miR-31的共同靶基因。進(jìn)一步通過Pubmed檢索發(fā)現(xiàn)CTNND2, KHD

9、RBS3, RHOA, TACC1及YWHAE等5個(gè)為與胃癌相關(guān)的基因,其中RHOA經(jīng)Western-Blot證實(shí)可能為miR-31作用于胃癌細(xì)胞的靶基因。
　　結(jié)論:
　　1.miR-31在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用:miR-31在胃癌組織中的表達(dá)較癌旁組織明顯降低,其表達(dá)豐度與胃癌組織的N分期呈負(fù)相關(guān);
　　2.miR-31可抑制胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力,但對(duì)細(xì)胞的凋亡增殖無明顯影響;
　　3.預(yù)測(cè)RhoA