腹腔巨噬細(xì)胞功能變化在胃癌腹腔種植轉(zhuǎn)移中的作用及機制研究.pdf

1、目的
　　胃癌腹腔種植轉(zhuǎn)移是胃癌術(shù)后最主要的死亡原因，腹腔鏡胃癌根治手術(shù)是否增加腹腔種植轉(zhuǎn)移是目前關(guān)注的重要問題，腹腔巨噬細(xì)胞作為腹腔最重要的免疫細(xì)胞，在胃癌腹腔種植轉(zhuǎn)移中的作用及其可能機理目前尚不清楚。為此，本課題通過以下三個方面研究：（1）胃癌腹腔巨噬細(xì)胞功能改變對胃癌腹腔種植轉(zhuǎn)移的影響；（2）TGF-β1誘導(dǎo)腹腔巨噬細(xì)胞功能改變的可能機制；（3）CO2氣腹環(huán)境下胃癌腹腔巨噬細(xì)胞功能變化以及對胃癌腹腔種植轉(zhuǎn)移的影響研究，探討胃

2、癌腹腔巨噬細(xì)胞功能變化對胃癌腹腔種植轉(zhuǎn)移中的影響及其可能機制，為臨床胃癌術(shù)后腹腔種植轉(zhuǎn)移的防治提供新的理論依據(jù)。
　　研究方法與結(jié)果:
　　第一部分：腹腔巨噬細(xì)胞功能改變對胃癌腹腔種植轉(zhuǎn)移的影響
　　方法：將36只615小鼠隨機分為3組，每組12只：A組：對照組正常小鼠，B組：小鼠前胃癌細(xì)胞（MFC）原位移植組，C組：小鼠前胃癌細(xì)胞（MFC）原位移植＋抗TGF-β1抗體組。10天后處死小鼠，腹腔注入培養(yǎng)液，收集腹腔巨噬

3、細(xì)胞離心，離心液檢測各組TGF-β1的濃度，將巨噬細(xì)胞培養(yǎng)12h、24h、48h、72h，檢測其吞噬功能及產(chǎn)生的NO、TNF-α、IL-10、VEGF水平變化。觀察各組小鼠的腹腔種植轉(zhuǎn)移率及種植結(jié)節(jié)重量。結(jié)果：A、B、C組小鼠腹腔液體TGF-β1的濃度分別為17.56±5.02pg/ml、224.04±12.36pg/ml、50.37±10.82pg/ml，B、C組顯著高于A組(P＜0.05)，C組顯著低于B組(P＜0.05)。B、C組

4、小鼠腹腔巨噬細(xì)胞在培養(yǎng)12h、24h、48h、72h吞噬功能，分泌NO、TNF-α水平顯著低于A組(P＜0.05)，B組與C組比較，B組顯著低于C組(P＜0.05)；B、C組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞在培養(yǎng)12h、24h、48h、72h分泌IL-10、VEGF水平顯著高于A組(P＜0.05)，B組與C組比較，B組顯著高于C組(P＜0.05)；C組小鼠在10天的腹腔種植轉(zhuǎn)移率為41.66％（5/12），顯著低于B組小鼠100％（12/12），種植結(jié)

5、節(jié)重量C組為0.52±0.24g，顯著低于B組1.08±0.17g。
　　第二部分：TGF-β1在誘導(dǎo)腹腔巨噬細(xì)胞功能變化中的作用及其機理
　　方法：培養(yǎng)小鼠前胃癌細(xì)胞（MFC），檢測培養(yǎng)上清TGF-β1含量，采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察MFC TGF-β1蛋白表達。分離純化小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，采用重組TGF-β1刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，檢測腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能,分泌NO，TNF-α、IL-10、VEGF變化，采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色、

6、Western blotting觀察小鼠腹腔巨噬細(xì)胞SMAD2/3、SMAD4、SMAD7、VEGF表達。結(jié)果：小鼠前胃癌細(xì)胞高表達TGF-β1，1×106/ml MFC培養(yǎng)48h上清液TGF-β1濃度為107.56±4.82pg/ml。采用100pg/ml的TGF-β1刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，與正常小鼠腹腔巨噬細(xì)胞相比，24h、48h、72h吞噬功能顯著降低(P＜0.05)，分泌NO、TNF-α水平顯著減少(P＜0.05)，分泌IL-1

7、0、VEGF顯著增加(P＜0.05)。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示重組TGF-β1刺激組VEGF、SMAD2/3、SMAD4、SMAD7在24h、48h、72h均較對照組表達顯著增強，Western-blotting也取得了類似的結(jié)果。
　　第三部分：CO2氣腹對胃癌小鼠腹腔巨噬細(xì)胞功能及腹腔種植轉(zhuǎn)移的影響
　　方法：建立615小鼠前胃癌細(xì)胞小鼠原位移植模型，將其隨機分為6組，每組30只:單純麻醉組、開腹組、小切口開腹組、2 mmH

8、g CO2氣腹組、4 mmHg CO2氣腹組和6 mmHg CO2氣腹組。術(shù)后每組各取6只小鼠收集培養(yǎng)腹腔巨噬細(xì)胞,檢測巨噬細(xì)胞培養(yǎng)12 h、24 h、48 h、72 h吞噬功能及產(chǎn)生的NO、TNF-α、IL-10、VEGF水平。其余小鼠2周后觀察小鼠前胃癌細(xì)胞腹腔種植轉(zhuǎn)移率及種植結(jié)節(jié)的總重量。結(jié)果：術(shù)后腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能以及分泌NO、TNF-α、IL-10、VEGF值開腹組及小切口開腹組在培養(yǎng)12 h與單純麻醉組比較，顯著升高(P＜

9、0.05)，2 mmHg在培養(yǎng)12 h顯著低于開腹組(P＜0.05)，4 mmHg CO2氣腹組在培養(yǎng)12 h顯著低于單純麻醉組和開腹組(P＜0.05)，6 mmHg CO2氣腹組小鼠術(shù)后腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能以及分泌NO、TNF-α、IL-10、VEGF在培養(yǎng)12 h、24 h均顯著低于單純麻醉組和開腹組(P＜0.05)。6 mmHg CO2氣腹組小鼠前胃癌腹腔種植轉(zhuǎn)移率顯著高于開腹組(75％比50％，P＜0.05)。開腹組、2 mmH

10、g、4 mmHg、6 mmHg CO2氣腹組腹腔種植結(jié)節(jié)總重量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　?。?）胃癌小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能與分泌NO，TNF-α水平下降，分泌IL-10、VEGF水平升高，腹腔巨噬細(xì)胞功能變化與胃癌的腹腔種植轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。
　?。?）TGF-β1能夠抑制腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能與NO，TNF-α的分泌，能夠促進IL-10、VEGF的分泌，其機理可能與TGF-β1激活了腹腔巨噬細(xì)