miR-27b在胃癌中的生物學功能及表遺傳學調(diào)控機制研究.pdf

1、前言:腫瘤目前已經(jīng)成為了常見病多發(fā)疾病。據(jù)估算，在世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤中，胃癌排名第四，而在腫瘤引起的相關死亡中胃癌排名第二。研究表明，異常的miR-27b表達發(fā)生在多種腫瘤中，包括胃癌。然而，miR-27b在胃癌中調(diào)控機制及其生物學功能和臨床意義尚且未知，因此，在本研究中，我們對miR-27b在胃癌中的表達情況，以及其miR-27b對胃癌細胞生物學行為的影響進行了研究，在此基礎上，我們從表遺傳學角度對miR-27b在胃癌細胞的異

2、常表達進行了深入分析。
　　材料和方法:1.80對胃組織樣本，包括80例胃癌組織和配對的癌旁正常組織，被用于本實驗研究。他們來自于2013-2014年在中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院被確診為胃癌的患者，這些患者在手術之前未進行放化療等任何其他治療手段。2.所有組織進行H&E染色處理并進行組織學診斷。3.四株胃癌細胞BGC-823，MGC-803，SGC-7901，MKN-45和一株正常胃粘膜上皮細胞GES-1。所有的細胞均培養(yǎng)在含10％

3、胎牛血清的細胞培養(yǎng)基中，并被放入含5％二氧化碳的37℃的恒溫箱中進行培養(yǎng)。4.Trizol試劑被用在本實驗中對全基因組RNA進行提取。miR-27b在胃癌細胞系和胃癌組織中的表達量通過實時定量RT-PCR進行定量檢測。4.在轉染試劑的作用下，miR-27b低表達的胃癌細胞分別被轉入miR-27b mimics、miR-27b Inhibitor、scramble，或者未被轉染。細胞增殖、轉移、侵襲和細胞凋亡實驗被用來研究miR-27b對

4、胃癌細胞惡性生物學行為的影響。5.在線生物預測軟件預測miR-27b的可能靶基因，通過查閱文獻進一步篩選，并利用雙熒光素酶基因報告實驗進行驗證。Western blot檢測靶基因在胃癌組織和細胞中的蛋白表達情況。6.去甲基化藥物5-AZA-CdR and/or TSA處理胃癌細胞。MSP進行檢測胃癌細胞系和胃組織中miR-27b基因啟動子區(qū)CpG島甲基化水平。6.利用SPSS17.0軟件對胃癌組織及癌旁正常組織中miR-27b的表達水平

5、進行統(tǒng)計學分析。主要統(tǒng)計方法采用t檢驗（或者方差分析），P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義，P＞0.05表示差異無統(tǒng)計學意義。
　　結果:1.與正常胃粘膜上皮細胞相比，miR-27b在胃癌細胞株(MKN-45，SGC-7901，BGC-823，MGC-803)中表達水平明顯降低。同時，我們發(fā)現(xiàn)miR-27b在胃癌組織中的表達水平相比在癌旁正常組織中的表達水平更低。2.表達miR-27b可以抑制胃癌細胞增殖、侵襲、轉移并誘導細胞凋亡。

6、下調(diào)miR-27b表達促進胃癌細胞增殖、侵襲并抑制胃癌細胞凋亡。3.通過甲基化特異性PCR檢測發(fā)現(xiàn)，與正常胃癌粘膜上皮細胞相比，胃癌細胞中miR-27b啟動子區(qū)CpG島呈現(xiàn)異常高甲基化狀態(tài)，在胃癌細胞系MKN-45中尤為明顯。并且，我們也發(fā)現(xiàn)，在miR-27b低表達的胃癌組織中miR-27b啟動子區(qū)CpG島呈現(xiàn)出比miR-27b高表達的胃癌組織中更高的甲基化水平。更重要的是，我們發(fā)現(xiàn)，miR-27b啟動子區(qū)的這種高甲基化狀態(tài)可以被去甲基

7、化藥物5-Aza-dC部分逆轉。4.miR-27b通過與GSPT13'UTRs結合而抑制其蛋白表達。結論:我們的研究表明，異常低表達的miR-27b在胃癌中扮演了腫瘤抑制基因的作用，并且miR-27b低表達部分原因是其啟動子區(qū)CpG島高甲基化;這說明miR-27b可能具有發(fā)展為胃癌潛在的治療靶標。
　　結論:我們的研究表明，下調(diào)表達的miR-27b在胃癌中扮演了抑癌基因的角色，它的低表達部分是由于其啟動子區(qū)CpG島高甲基化，這些結