miRNA-181a在胃癌中的表達及功能研究.pdf

1、研究背景：
　　微小 RNA(microRNAs，miRNAs)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類長約21-25個核苷酸的內(nèi)源性單鏈非編碼 RNA，在動物及植物中均有表達。miRNAs通常在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達。miRNA與靶基因結(jié)合的關鍵部位稱為“種子區(qū)域”(seed region，miRNA5?末端開始2-7個核苷酸)，與miRNA3?UTR通過堿基配對結(jié)合。miRNAs調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡、分化以及遷移等重要的生物學過程。miRNAs表

2、達和代謝的異常還與多種疾病如腫瘤密切相關。一些miRNAs在腫瘤組織中表達異常，促進了腫瘤的發(fā)生和進展，其作用相當于致癌基因或抑癌基因。目前已有證據(jù)提示miRNAs可應用于腫瘤的基因診斷和治療。
　　中國是胃癌高發(fā)的國家，據(jù)世界權(quán)威專家估計，全世界每年新發(fā)現(xiàn)的胃癌患者約為75.5萬例，其中大約35％來自中國。我國胃癌發(fā)病率和死亡率在世界上都處于較高水平。雖然目前采取了包括手術、化療以及其它綜合性治療措施，但胃癌的治療效果仍不是十分

3、理想，五年生存率低下。這是由于我們對于胃癌的發(fā)病機理尚缺乏更全面和深入的了解，臨床上也缺乏特異性的胃癌腫瘤標記物，因此，深入研究胃癌的發(fā)生發(fā)展機制，尋找新的生物標記物和治療靶標，提高胃癌的早期診斷率和臨床預后都是擺在醫(yī)學工作者面前的必須攻克的難題。
　　我們前期工作已應用miRNA基因芯片(Illumina公司)，并通過應用熒光定量RT-PCR技術證實miR-181a在胃癌中為高表達。
　　目的：
　　本實驗將在前期實

4、驗的基礎上，研究miRNA-181a（miR-181a）在胃癌細胞系中的表達和功能，并且探索其可能的分子機制。
　　方法：
　　用qRT-PCR分析miR-181a在胃癌細胞SGC-7901、MGC-803、BGC-823表達情況，結(jié)合細胞的增殖和分化特征，篩選合適的胃癌細胞株進行下一步實驗；構(gòu)建質(zhì)粒miR-181a Inhibitor，使用miR-181a Inhibitor和陰性對照（質(zhì)粒NC）轉(zhuǎn)染胃癌 SGC-7901

5、細胞，通過相差顯微鏡觀察以及 MTS、流式細胞儀(FACS)、Transwell細胞遷移和細胞侵襲實驗等技術和方法分析miR-181a對胃癌細胞的細胞周期、增殖與凋亡、遷移與侵襲等生物學行為的影響；應用miRanda、Pictar和targetscan等生物信息學方法對miR-181a靶基因進行預測，雙螢光素酶報告系統(tǒng)驗證miR-181a的靶基因(ATM和KLF6)的；Western Blot檢測胃癌細胞中ATM和KLF6蛋白的變化；選

6、取9例胃癌患者標本研究胃癌和非癌組織表達的miR-181a和靶基因表達的相關性。
　　結(jié)果：
　　1．miR-181a在胃癌組織和胃癌細胞中表達升高，miR-181a的高表達和胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及年齡相關，與性別及腫瘤分化程度無關。在本實驗的60例胃癌中，有52例(86.67%)miR-181a表達升高，升高倍數(shù)平均值為5.45。
　　2．以三個胃非癌組織中 miR-181a的表達量平均值為對照，miR-181a在SG

7、C-7901、MGC-803、BGC-823胃癌細胞株中明顯高表達，增高的倍數(shù)分別是26.68、14.83、14.96倍；miR-181a在胃癌SGC-7901細胞中表達最高，我們選擇該細胞系進行后續(xù)實驗。
　　3．外源性沉默表達miR-181a能顯著抑制胃癌SGC-7901細胞的增殖、遷移、侵襲以及克隆形成，促進細胞凋亡。
　　4．miR-181a直接和負性調(diào)控抑癌基因ATM和KLF6的表達。使用生物信息學方法分析，預測出

8、ATM和KLF6是miR-181a的靶基因。雙熒光素酶報告系統(tǒng)證實ATM和KLF6是miR-181a的下游靶點；Western Blots進一步證實轉(zhuǎn)染miR-181a inhibitor后，靶蛋白表達出現(xiàn)明顯差異。推斷miR-181a發(fā)揮抑制靶蛋白ATM和KLF6的表達作用是通過直接與靶基因3?-非翻譯區(qū)結(jié)合。
　　5．應用RT-PCR及Westen Blot檢測9對胃癌病人的miR-181a與ATM和KLF6的表達水平，并發(fā)現(xiàn)

9、相對于非癌正常組織，絕大多數(shù)胃癌組織中的miR-181a為高表達，而且其靶基因ATM和KLF6在絕大多數(shù)標本中為低表達，差別具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；分析ATM和KLF6的蛋白水平和miR-181a的表達水平存在明顯的負相關性，相關系數(shù)為；ATM：-0.539，P=0.021＜0.05；KLF6：-0.590，P=0.010＜0.05。
　　結(jié)論：
　　1．miR-181a在胃癌組織和胃癌細胞中高表達，miR-181a

10、高表達和胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及年齡相關，與性別及腫瘤分化程度無關。
　　2．miR-181a在胃癌發(fā)病是致癌性miRNA。抑制miR-181a表達，可以明顯抑制胃癌 SGC-7901細胞功能，諸如增殖，生長，遷移，侵襲，克隆形成，促進凋亡；提示miR-181a表達水平可能參與細胞功能的分子調(diào)控，有可能成為胃癌治療的分子靶點。
　　3．在胃癌組織中miR-181a和抑癌基因ATM和KLF6蛋白的表達水平呈現(xiàn)負相關性。miR-18