RhoE在胃癌轉(zhuǎn)移中的作用和機制研究.pdf

1、胃癌在我國發(fā)病率高,是嚴重威脅人民健康和生活質(zhì)量的惡性腫瘤。目前對于胃癌發(fā)生、發(fā)展及侵襲、轉(zhuǎn)移的分子機制并不十分清楚,影響了胃癌治療的效果以及治療方法的改進與發(fā)展。Rho蛋白家族是GTP蛋白酶Ras超家族中的一部分,對細胞許多的生理生化過程,如細胞增殖、轉(zhuǎn)化、遷移以及形態(tài)等起著重要的調(diào)控作用。大多數(shù)Rho蛋白都有兩種存在形式:與GTP結(jié)合的活性形式及與GDP結(jié)合的非活性形式。RhoE/ Rnd3是Rho蛋白家族的亞家族(Rnd蛋白家族)

2、的成員之一,RhoE雖然可以結(jié)合GTP,卻并沒有GTP酶活性,不能水解GTP,因此在體內(nèi)只存在與GTP結(jié)合形式。這種特性賦予RhoE許多不同于Rho家族蛋白的功能,例如抑制肌動蛋白細胞骨架形成,阻滯細胞周期進展,抑制多種因素誘發(fā)的細胞凋亡,增強細胞的運動能力以及調(diào)控細胞的形態(tài)變化。在腫瘤中因其在某些腫瘤中表達上調(diào)(例如胰腺癌、黑素瘤和非小細胞肺癌)而在某些腫瘤中表達下調(diào)(例如前列腺癌),RhoE可作為腫瘤診斷或預(yù)測預(yù)后的分子。研究證明,

3、RhoE蛋白通過調(diào)控多種組織細胞內(nèi)肌動蛋白細胞骨架的形成能夠促進細胞的遷移能力以及腫瘤細胞的侵襲能力。我實驗室前期的研究發(fā)現(xiàn):RhoE能夠通過抑制BAX促進胃癌多藥耐藥,但該分子對于胃癌其他惡性表型有無作用尚未見報道,我們前期利用Western blot的方法檢測RhoE在胃癌組織中的表達情況,結(jié)果顯示:發(fā)生轉(zhuǎn)移的胃癌組織原發(fā)灶中RhoE蛋白表達水平顯著高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的胃癌組織原發(fā)灶,提示RhoE可能在胃癌的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用,RhoE

4、參與胃癌侵襲與轉(zhuǎn)移的具體作用和機制尚有待進一步研究。
　　目的:1.檢測RhoE蛋白在發(fā)生轉(zhuǎn)移的胃癌組織原發(fā)灶及無轉(zhuǎn)移的胃癌組織原發(fā)灶中的表達情況以及檢測RhoE在蛋白水平和mRNA水平在轉(zhuǎn)移潛能不同的胃癌細胞系中的表達情況。在蛋白水平和mRNA水平研究RhoE與胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系。
　　2.設(shè)計并構(gòu)建RhoE的正義載體,應(yīng)用瞬時和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染技術(shù)探討增加細胞內(nèi)的RhoE表達對胃癌細胞體外遷移,侵襲能力和體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的改變,為

5、進一步揭示RhoE蛋白在胃癌轉(zhuǎn)移中的作用機理提供理論依據(jù)。
　　3.初步探討RhoE作用于胃癌轉(zhuǎn)移的下游分子機制。
　　方法:1.利用免疫組織化學和Western blot方法檢測RhoE在正常胃組織,發(fā)生轉(zhuǎn)移的胃癌組織原發(fā)灶,未發(fā)生轉(zhuǎn)移的胃癌組織原發(fā)灶以及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的表達。
　　2.利用Western blot方法分別檢測RhoE在蛋白水平上在轉(zhuǎn)移潛能不同的胃癌SGC7901-M和SGC7901-NM中的表達。

6、r>　　3.利用半定量PCR和qRT-PCR方法檢測RhoE在mRNA水平上在轉(zhuǎn)移潛能不同的胃癌SGC7901-M和SGC7901-NM中的表達。
　　4.設(shè)計和構(gòu)建RhoE正義表達載體,將構(gòu)建正確的編碼RhoE的質(zhì)粒和空載體分別通過瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)入胃癌細胞SGC7901。
　　5.利用Western blot鑒定瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染效果。
　　6.損傷刮擦實驗分析轉(zhuǎn)染細胞體外遷移能力的改變。
　　7.

7、TRANSWELL侵襲實驗分析轉(zhuǎn)染細胞體外侵襲能力的改變。
　　8.裸鼠尾靜脈體內(nèi)轉(zhuǎn)移實驗觀察轉(zhuǎn)染細胞及其對照細胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力差異。
　　9.Western blot方法檢測轉(zhuǎn)染RhoE正義載體及對照的胃癌細胞系中MMP分子的蛋白表達。
　　結(jié)果:1.免疫組織化學結(jié)果顯示:正常胃組織中RhoE的陽性表達率較高,為73.5％,在胃癌組織中僅為23.5％,與正常胃組織相比表達水平也顯著下降(p＜0.05);RhoE在發(fā)生

8、轉(zhuǎn)移的胃癌原發(fā)灶中的陽性表達率為41.2％,顯著高于其在未發(fā)生轉(zhuǎn)移的胃癌原發(fā)灶中的陽性表達率5.9％(p＜0.05);RhoE在發(fā)生轉(zhuǎn)移的胃癌原發(fā)灶中的表達水平也顯著高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的胃癌原發(fā)灶(p＜0.05);RhoE在胃癌原發(fā)灶中的表達水平與在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的表達水平則無顯著差異;RhoE主要定位于正常胃組織細胞和胃癌細胞的細胞漿。
　　2.Western blot的結(jié)果顯示:在12例發(fā)生轉(zhuǎn)移的胃癌組織原發(fā)灶標本中可檢測到RhoE

9、的過表達(8/12,66.7％),而12例未發(fā)生轉(zhuǎn)移的胃癌組織原發(fā)灶標本中僅有1例檢測到RhoE表達(1/12,8.3％),與免疫組化結(jié)果一致。
　　3.Western blot,半定量PCR和qRT-PCR方法對轉(zhuǎn)移潛能不同的胃癌細胞系的檢測結(jié)果顯示:在蛋白水平和mRNA水平上,RhoE在轉(zhuǎn)移潛能高的胃癌SGC7901-M細胞系中表達較強,在轉(zhuǎn)移潛能低的胃癌SGC7901-NM細胞系中表達較弱(p＜0.05)。
　　4.胃

10、癌SGC7901細胞瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染RhoE正義表達載體后,Western blot結(jié)果顯示RhoE表達明顯上調(diào)。
　　5.利用RhoE正義表達載體轉(zhuǎn)染上調(diào)胃癌細胞SGC7901中RhoE的表達,可增強細胞的體外遷移和侵襲能力(p＜0.05)。
　　6.裸鼠尾靜脈注射轉(zhuǎn)移實驗結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染了RhoE正義表達載體的胃癌SGC7901細胞注入裸鼠體內(nèi)后與對照組相比,腫瘤在肺臟的轉(zhuǎn)移發(fā)生率明顯升高(p＜0.05)。
　　7

11、.Western blot檢測顯示,利用RhoE正義表達載體轉(zhuǎn)染胃癌SGC7901細胞后,細胞中的基質(zhì)金屬蛋白酶分子MMP9水平明顯升高,而MMP2的表達水平則無明顯變化。
　　結(jié)論:1.與正常胃組織相比,RhoE在胃癌組織中的表達水平下降;而與未發(fā)生轉(zhuǎn)移的胃癌組織原發(fā)灶相比,RhoE在發(fā)生轉(zhuǎn)移的胃癌組織原發(fā)灶中表達水平明顯增強,同時,RhoE在轉(zhuǎn)移潛能高的胃癌細胞系中的表達水平明顯高于轉(zhuǎn)移潛能低的胃癌細胞系。
　　2.利用