高糖對腦微血管內(nèi)皮細胞抗氧化系統(tǒng)和ATP水平的影響及白藜蘆醇的干預(yù)機制研究.pdf

1、第一部分高糖對腦微血管內(nèi)皮細胞抗氧化系統(tǒng)及ATP水平的影響
　　 糖尿病認知功能損傷與腦微血管并發(fā)癥密切相關(guān)，一般認為是持續(xù)高糖對腦微小血管侵害導(dǎo)致腦組織缺血缺氧的結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病動物模型腦內(nèi)ATP水平下降，是否也與認知損傷有一定關(guān)系?糖尿病微血管病變部位是否也同樣存在這種能量代謝障礙以及其具體機制如何目前尚未見相關(guān)研究。氧化應(yīng)激是糖尿病微血管病變產(chǎn)生的一個非常關(guān)鍵的致病機制，盡管細胞內(nèi)存在銅鋅超氧化物岐化酶(SOD1)、

2、錳超氧化物岐化酶(SOD2)、過氧化氫酶(CAT)及脂質(zhì)過氧化物酶(GPX)等多種抗氧化酶，然而高糖刺激時血管內(nèi)皮細胞仍然會產(chǎn)生大量氧自由基。因此我們猜測高糖刺激時腦微血管內(nèi)皮細胞，尤其氧自由基大量產(chǎn)生的線粒體部位某些關(guān)鍵的抗氧化酶可能出現(xiàn)了調(diào)控障礙，影響了自由基的清除，導(dǎo)致細胞ATP水平下降。解耦聯(lián)蛋白(UCP)系統(tǒng)在線粒體內(nèi)具有降低ATP生成和清除自由基的雙重功能，線粒體內(nèi)抗氧化酶的調(diào)控障礙，是否可能會引起解耦聯(lián)蛋白的上調(diào)，從而進一

3、步導(dǎo)致細胞ATP水平下降。
　　 為驗證我們的假設(shè)，我們通過體外培養(yǎng)的小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞系bEnd.3，采用H2DCF熒光法檢測氧自由基(ROS)生成，RT-PCR檢測高糖刺激下內(nèi)皮細胞SOD1、SOD2、GPX、CAT、UCP1、UCP2、UCP3、UCP4、UCP5的表達，并通過wersternblot法檢測內(nèi)皮細胞內(nèi)SOD2蛋白水平。結(jié)果顯示高糖刺激10小時抗氧化酶SOD2、GPX、CAT的mRNA水平無明顯變化，SOD

4、1 mRNA水平略有增高；SOD1、SOD2的mRNA水平在高糖刺激24小時后有明顯增加，但是SOD2蛋白水平在高糖刺激48小時內(nèi)并無明顯增加，蛋白酶體抑制劑MG132能顯著減少高糖下SOD2蛋白水平，提示高糖下SOD2的蛋白合成可能受到一定程度抑制；我們還觀察到NF-kB抑制劑及顯性負性突變體IkB(Dominant negtive IkB)和PI3K抑制劑能上調(diào)高糖狀態(tài)下的SOD2蛋白水平，而NF-kB抑制劑對高糖下SOD2 mRN

5、A水平無明顯影響，提示NF-kB可能是通過提高高糖下SOD2蛋白合成率起作用,NF-KB抑制劑對高糖下的氧自由基生成也顯示出抑制作用。另外我們還觀察到24小時高糖刺激下腦微血管內(nèi)皮細胞能同時上調(diào)解耦聯(lián)蛋白(UCP4、UCP5)mRNA水平，而對UCP1及UCP2無明顯影響。NF-kB抑制劑有降低UCP5基因表達的趨勢，但沒有達到顯著性，提示UCP5激活可能還有其他因素參與。我們也觀察到高糖刺激能顯著降低腦微血管內(nèi)皮細胞的ATP水平，而N

6、F-kB抑制劑有升高ATP水平的趨勢但沒有能達到顯著性，可能與NF-kB抑制劑對UCP作用不明顯有關(guān)。
　　 我們的研究結(jié)果提示高糖確實導(dǎo)致了腦微血管內(nèi)皮細胞內(nèi)SOD2蛋白翻譯障礙，NF-kB激活可能參與其中；高糖同時也引起腦微血管內(nèi)皮細胞內(nèi)UCP4及UCP5上調(diào)，但這種上調(diào)并非完全由SOD2調(diào)控障礙引起；高糖顯著性的導(dǎo)致了腦微血管內(nèi)皮細胞ATP水平下降，但是否與SOD2調(diào)控障礙以及UCP蛋白上調(diào)密切相關(guān)還需進一步研究。

7、　　 第二部分白藜蘆醇對高糖下腦徽血管內(nèi)皮細胞NADPH氧化酶的影響及干預(yù)機制
　　 近年來越來越多的證據(jù)提示，高糖刺激下還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶活性增高引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)對糖尿病微血管和大血管病變的病情發(fā)展起重要作用。NADPH氧化酶廣泛分布于血管內(nèi)皮細胞，具有產(chǎn)生活性氧簇(ROS)的功能，尤其在細胞因子、高糖、高脂等作用下可以產(chǎn)生更高水平的ROS。白藜蘆醇(Resveratrol)是一種常見于葡萄

8、、虎杖等植物中的一種多酚類化合物，目前的研究顯示它具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎以及延緩衰老等多種藥理功能，流行病學(xué)調(diào)查也顯示白藜蘆醇對心血管有顯著的保護作用。白藜蘆醇良好的抗氧化作用是否是能通過作用于糖尿病狀態(tài)下腦微血管內(nèi)皮細胞NADPH氧化酶，以降低細胞損傷水平?本課題在離體水平研究了白藜蘆醇在高糖所致腦微血管內(nèi)皮細胞損傷中的保護機制以及對NADPH氧化酶的影響。我們在標準糖濃度下(5.5mM)體外培養(yǎng)bEnd.3細胞系并利用高糖(25m

9、M)刺激細胞，用H2DCF-DA、MTT、Hoechst33258及化學(xué)發(fā)光法檢測高糖下腦微血管內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激水平、細胞活性、凋亡狀況及NADPH氧化酶活性。RT-PCR和Western blot分別在mRNA、蛋白質(zhì)水平檢測高糖刺激下NADPH氧化酶亞基NOX1、NOX2、p22phox表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)高糖刺激下腦微血管內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激水平顯著增加，細胞活性降低，凋亡增加。同時NADPH氧化酶活性增加，其亞基NOX1基因表達增加，

10、蛋白水平升高，而NOX2及p22phox亞基mRNA水平無明顯變化。NADPH氧化酶抑制香草乙酮(apocynin)及白藜蘆醇能顯著降低高糖刺激下腦微血管內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激水平和凋亡水平；白藜蘆醇同時能降低NADPH氧化酶活性，降低NOX1 mRNA及蛋白水平。實驗同時證實高糖能激活NF-kB信號通路，NF-kB抑制劑及顯性負性突變體IkB(Dominant negative IkB)能顯著抑制高糖下NOX1亞基的蛋白水平升高，而白藜蘆醇