白藜蘆醇對高糖誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞增殖的影響及其機制的研究.pdf

1、目的:
　　糖尿病是一種代謝紊亂疾病，可以導(dǎo)致糖尿病特有的微血管并發(fā)癥（視網(wǎng)膜病變、腎病、神經(jīng)病變）和大血管并發(fā)癥（心血管疾病和中風(fēng)），最終導(dǎo)致壽命縮短。糖尿病視網(wǎng)膜病(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病常見和嚴重的微血管并發(fā)癥之一，是成人后天性致盲的主要原因，在失明的患者中85％是由DR引起。DR的特點是新生血管形成，發(fā)病機制一般認為是由于視網(wǎng)膜微血管系統(tǒng)受損所致，是多種因素相互作用導(dǎo)致，主要包括周細胞丟

2、失、視神經(jīng)網(wǎng)膜異常和新生血管形成。而視網(wǎng)膜毛細血管內(nèi)皮細胞增生是新生血管形成的前提。
　　白藜蘆醇(Resveratrol，Res)是從紅酒內(nèi)提取的多酚類物質(zhì)，它對眼部的主要作用包括:抗氧化應(yīng)激、抗細胞凋亡、抗腫瘤基因、抗炎、抗血管生成以及血管舒張?；谛卵苌墒翘悄虿⊙鄄“l(fā)生發(fā)展的病理機制之一，本研究觀察了Res對高糖環(huán)境下人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞（HRCECs）增殖和細胞周期的干預(yù)作用，并對其分子機制進行了探討，為Res在糖尿病

3、眼病治療方面提供了新的實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1、細胞增殖活性的檢測
　　將處于對數(shù)生長期的人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞（HRCECs）接種于96孔板中，分為:高滲組(M)（25 mmol/L甘露醇），正常糖濃度組(N)（5.5 mmol/L葡萄糖），高糖組(H)（25 mmol/L葡萄糖），高糖+白藜蘆醇組(R)（R1、R2、R3、R4組分別為25mmol/L葡萄糖加入25、50、100、200μmol/L Res），作

4、用24 h后用CCK-8法檢測細胞增殖活性。
　　細胞計數(shù)檢測藥物作用24h后的HRCECs細胞增殖活性，處理條件同上。
　　2、細胞周期的檢測
　　分為高滲組(M)（加入25 mmol/L甘露醇），正常糖濃度組(N)（5.5 mmol/L葡萄糖），高糖組(H)（25 mmol/L葡萄糖），高糖+白藜蘆醇組(R)（R2、R3組分別為25mmol/L葡萄糖加如50、100μmol/L Res），培養(yǎng)24h后，用流式細胞儀

5、檢測細胞周期分布情況。
　　3、分組情況同方法2，Westem blot及real-time PCR法檢測細胞周期相關(guān)蛋白及其上游mRNA的表達情況。
　　結(jié)果:
　　1、細胞增殖活性的檢測:與正常糖濃度組(N)相比，高滲組(M)細胞增殖活性無顯著性差異，而高糖組(H)細胞增殖活性則明顯增高(P＜0.05);不同濃度的Res處理24h后，R1、R2、R3、R4組細胞增殖活性較高糖組分別下降了4％、11％、16、47％，

6、其中R2、R3、R4組與高糖組比較有顯著性差異(P＜0.05)（Fig.2A）;
　　細胞計數(shù)分析結(jié)果顯示，與正常糖濃度組(N)相比，高滲組(M)無顯著性差異，而高糖組(H)細胞計數(shù)則明顯增高(P＜0.05);用不同濃度的Res作用HRCECs細胞24 h后，細胞數(shù)目明顯減少，與H組相比，R1、R2、R3、R4組細胞數(shù)量分別減少了17％、41％、58％、75％(P均＜0.05)(Fig.2B, Fig.3)。
　　2、流式細

7、胞學(xué)結(jié)果:高糖組(H)S期的細胞數(shù)目明顯減少(P＜0.05)。高糖環(huán)境下不同濃度Res（50、100μmol/L）處理24h后，可使處于S期的細胞數(shù)顯著增加(P＜0.05），抑制高糖環(huán)境下HRCECs細胞周期進程（Fig.4，Table1）。
　　3、Western blot及Real-time PCR結(jié)果示:與正常糖濃度組(N)比較，高滲組(M)細胞的cyclin A1、CDK2、PCNA mRNA及蛋白的表達無顯著性差異，而高

8、糖組(H) cyclin A1、CDK2、PCNA的表達增加，P21CIP1表達下降，P均＜0.05; Res（50、100μmol/L）處理24h可劑量依賴性地抑制高糖下HRCRCs細胞的cyclin A1、CDK2、PCNA的表達，增加P21CIP1的表達量(P均＜0.05)(Fig.5-Fig.8，Table2，Table3)。
　　結(jié)論:
　　1、高糖培養(yǎng)可能通過對細胞進程的影響及上調(diào)cyclin A1、CDK2、P