Ghrelin對(duì)高糖誘導(dǎo)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)探討ghrelin對(duì)于高濃度葡萄糖環(huán)境下血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響及其可能的作用機(jī)制，期望能對(duì)ghrelin功能的深入研究做出一點(diǎn)貢獻(xiàn)。 方法： 1、細(xì)胞培養(yǎng) 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(ECV304)在低糖DMEM培養(yǎng)基和10％胎牛血清中于37℃、5％CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)，隔天換液，將傳至4-5代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。當(dāng)細(xì)胞呈對(duì)數(shù)生長后，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106/L，接種于6孔培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞生長至融合狀態(tài)后用無血清培

2、養(yǎng)基培養(yǎng)24h使細(xì)胞呈靜止?fàn)顟B(tài)，更換實(shí)驗(yàn)用液隨機(jī)分配為實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 2、吖啶橙(Acridine Orange，AO)和Hoechst33258熒光染色各組細(xì)胞按不同實(shí)驗(yàn)條件處理后，加入0.01％AO及100μL Hoechst33258工作液染色，熒光顯微鏡下觀察。 3、流式細(xì)胞儀分析凋亡收集實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞，70％酒精固定過夜，1000rpm/min離心10min，棄上清，加PBS洗二次，棄上清，吹打管底，加

3、入1000μg/L碘化丙錠(PI)500μL，4℃避光放置30min，流式細(xì)胞儀上樣檢測(cè)，CellQuest 3.0采集細(xì)胞，MedFit LT 3.0軟件分析細(xì)胞周期。 4、TUNEL檢測(cè)凋亡各組細(xì)胞按不同實(shí)驗(yàn)條件處理后，收集各組細(xì)胞，制成細(xì)胞涂片，4％多聚甲醛固定20min，PBS洗三次，按TUNEL試劑盒操作：標(biāo)本片加標(biāo)記緩沖液18μl/片，加TdT和DIG-d-DTP各1μl，濕盒37℃孵箱中標(biāo)記2h，0.01mol/L

4、 TBS洗2min×3次，加封閉液50 μl/片，室溫30min，抗體稀釋液1：100稀釋生物素化抗地高辛抗體，50μl/片加至標(biāo)片上，置濕盒37℃反應(yīng)30min，0.01mol幾TBS洗2min×3次，抗體稀釋液1：100稀釋SABC，混勻后50μl/片，37℃反應(yīng)30min，0.01mol/L TBS洗5min×4次，DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染，沖洗，封片，顯微鏡下觀察細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為凋亡細(xì)胞，結(jié)果用MetaMorph/DP

5、10/BX41顯微圖像分析系統(tǒng)分析，以每片取5個(gè)最強(qiáng)的染色區(qū)域，400倍鏡下計(jì)數(shù)各區(qū)域陽性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算出每區(qū)域陽性細(xì)胞百分比，即凋亡指數(shù)，以5個(gè)區(qū)域凋亡指數(shù)的平均值作為每組的凋亡指數(shù)。每組選取5張代表涂片計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)結(jié)果平均值作為各組凋亡百分率。 5、分光光度計(jì)檢測(cè)caspase-3活性各組細(xì)胞按不同實(shí)驗(yàn)條件處理后，收集各組細(xì)胞，PBS洗二次，2000rpm/min離心5min，去除PBS，沉淀細(xì)胞中加入50μl冰冷裂解

6、液和0.5μL DTT，吹打，冰上裂解60min，期間渦旋4次，每次10s，4℃10000rpm/min離心1min，吸取上清至新管中置冰上，測(cè)蛋白濃度，各組采用同樣蛋白量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，加50μL 2×Reaction Buffer/DTTMix，加5μL caspase-3 substrate(Ac-DEV-pNA)，37℃4h。分光光度計(jì)在400nm波長測(cè)定其吸光值，計(jì)算OD誘導(dǎo)劑/OD陰性對(duì)照確定各組caspase-3活化程度。

7、 6、流式細(xì)胞儀分析ROS實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后用無血清培養(yǎng)基洗二次，加入HBSS稀釋的DCFH-DA(2μmol/L)熒光探針37℃繼續(xù)孵育20min，DCFH-DA可穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，在胞內(nèi)轉(zhuǎn)化成DCFH，在活性氧存在的條件下被氧化生成熒光物質(zhì)DCF，以細(xì)胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度反應(yīng)活性氧水平，培養(yǎng)結(jié)束后冰PBS洗脫二次，收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。 7、Western-Blot分析磷酸化AKT(Ser473)、NF-κB(p

8、65)蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞用冰PBS洗二遍，細(xì)胞刷收集細(xì)胞，根據(jù)蛋白提取試劑盒操作分別提取各組細(xì)胞總蛋白及核蛋白，采用Bradford法測(cè)定蛋白濃度，每組蛋白質(zhì)樣本40μg在100℃下變性5min，進(jìn)行10％SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜后5％脫脂奶粉封閉2h，洗膜后加入5％BSA-TBS稀釋的抗磷酸化AKT(Ser473)多克隆抗體(1：200)、抗NF-κB(P65)單克隆抗體(1：1000)4℃孵育過夜，再次洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗

9、(1：5000)雜交2h，洗膜后ECL超敏發(fā)光液進(jìn)行顯色，每組重復(fù)3次，用同樣的方法顯示內(nèi)參β-actin條帶，結(jié)果用Scion Image分析軟件對(duì)目的條帶進(jìn)行灰度值分析。 8、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((-x)±s)表示，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次或3次以上，分析方法采用單因素方差分析，S-N-K法兩兩比較，p<0.05差異有顯著性。 結(jié)果： 1、相差顯微鏡下見正常人臍靜脈內(nèi)

10、皮細(xì)胞呈單層生長，呈短梭狀或鵝卵石狀貼壁緊密排列，細(xì)胞為多角形，吖啶橙染色熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞在正常濃度葡萄糖中培養(yǎng)72h細(xì)胞核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，呈均勻熒光；高糖組(33.3mmol/L)可見凋亡細(xì)胞，由于失去膜整合性、染色質(zhì)凝聚和核裂解，胞核致密濃染，呈多種形態(tài)；Ghrelin(10-7mol/L)預(yù)處理組染色質(zhì)凝聚、核裂解、致密濃染的細(xì)胞較高糖組明顯減少。Hoechst 33258熒光染色也得出相同結(jié)果。 2、流式細(xì)胞儀分析凋

11、亡，與對(duì)照組相比，高糖(33.3mmol/L)培養(yǎng)72h后增加內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率(p<0.05)，而ghrelin(10-7mol/L)預(yù)處理24h后加入高糖(33.3mmol/L)作用72h，與高糖組比較凋亡率明顯下降(p<0.05)。 3、TUNEL檢測(cè)凋亡結(jié)果，與對(duì)照組相比，高糖(33.3mmol/L)培養(yǎng)72h后增加內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率(p<0.05)，而ghrelin(10-7mol/L)預(yù)處理24h后加入高糖(33.3mmol

12、/L)作用72h，與高糖組比較凋亡率明顯下降(p<0.05)。 4、高糖(33.3mmol/L)呈時(shí)間依賴方式(24h-72h)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞caspase-3活性增加，用ghrelin(10-7mol/L)預(yù)處理24h，高糖(33.3mmol/L)繼續(xù)作用(24h-72h)，結(jié)果ghrelin預(yù)處理組與未預(yù)處理組比較caspase-3活性減低(p<0.01)。加入P13-Kinase特異性抑制劑LY294002(20μmol/L

13、)及ghrelin(10-7mol/L)作用24h，高糖(33.3mmol/L)繼續(xù)作用72h，結(jié)果加抑制劑組與未加抑制劑組比較caspase-3活性增高(p<0.05)。 5、內(nèi)皮細(xì)胞用或不用ghrelin(10-7mol/L)預(yù)處理24h后，高糖(33.3mmol/L)繼續(xù)作用24h、48h，結(jié)果與對(duì)照組相比，高糖組細(xì)胞內(nèi)ROS分別增加27％、35％(p<0.05)，ghrelin預(yù)處理組細(xì)胞內(nèi)ROS分別增加11％、14％，

14、預(yù)處理組比高糖組細(xì)胞內(nèi)ROS明顯減少(p<0.05)。 6、不同濃度ghrelin(10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L、10-9mol/L)作用內(nèi)皮細(xì)胞30min后磷酸化AKT蛋白表達(dá)增加(與對(duì)照組比較，p<0.05)，但后三者之間無差異(p>0.05)；ghrelin(10-7mol/L)分別作用內(nèi)皮細(xì)胞0min、10min、30min、60min、120min，磷酸化AKT蛋白在ghrelin作用30

15、min后表達(dá)達(dá)高峰(與對(duì)照組比較，p<0.01)。 7、高糖(33.3mmol/L)作用內(nèi)皮細(xì)胞(6h-24h)與對(duì)照組比較NF-KB(p65)蛋白表達(dá)逐漸增加(p<0.05)，ghrelin(10-7mol／L)作用內(nèi)皮細(xì)胞6h未見明顯NF-KB(p65)蛋白表達(dá)，ghrelin(10-7mol/L)加高糖(33.3mmol/L)作用24h較未加ghrelin組比較NF-KB(p65)蛋白表達(dá)下降(p<0.05)。 結(jié)

16、論： 1、高濃度葡萄糖作用內(nèi)皮細(xì)胞72h使細(xì)胞凋亡增加，ghrelin可以減少高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。 2、隨著作用時(shí)間延長(24h-72h)高濃度葡萄糖使內(nèi)皮細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白caspase-3活性增加，ghrelin可以抑制高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的caspase-3活性增加。 3、高濃度葡萄糖作用內(nèi)皮細(xì)胞(24h-48h)可以使ROS表達(dá)增加，ghrelin可以減少高濃度葡萄糖導(dǎo)致的ROS增加。 4、