小膠質細胞對腦微血管內皮細胞血管生成的影響及機制研究.pdf

1、背景及目的：
　　 小膠質細胞是中樞神經系統(tǒng)中最小的一種膠質細胞,它起源于胚胎期的骨髓單核細胞,在哺乳動物大腦發(fā)育胚胎期或新生期進入中樞神經系統(tǒng),為圓形或梭形的阿米巴樣小膠質細胞,主要分布于大腦皮層、胼胝體、皮層下白質、內被蓋、穹隆、小腦白質、視網膜等區(qū)域。正常情況下,小膠質細胞處于靜息或休眠狀態(tài),且數(shù)量較少,當中樞神經系統(tǒng)缺血、缺氧或受到損傷時,小膠質細胞作為中樞神經系統(tǒng)固有的免疫效應細胞,迅速被激活并發(fā)揮“雙刃”作用。目前研

2、究表明顯示,一方面,小膠質細胞可通過釋放細胞毒素、炎癥介質及細胞因子,加重腦組織的損傷;另一方面,活化的小膠質細胞又通過分泌細胞因子和神經生長因子促進神經組織的修復。一直以來,小膠質細胞發(fā)揮著重要的免疫細胞作用,分泌炎癥因子引發(fā)炎癥反應,在大腦中發(fā)揮著重要的作用,但是其對腦微血管內皮細胞血管生成的影響及機制還不清楚。
　　 腦微血管內皮細胞、星型膠質細胞、小膠質細胞、基膜及周細胞等共同組成了的高度特化的神經血管結構單元.血腦屏障

3、(blood-brain barrier,BBB)。其中腦微血管內皮細胞間的緊密連接和粘附連接是構成血腦屏障結構的基礎,也是維持血腦屏障功能的關鍵。最近研究顯示大腦血流的降低負性調節(jié)了記憶和學習中必需蛋白質的合成,并且也許最終導致了神經炎癥的發(fā)生和神經元的死亡。
　　 我實驗室研究發(fā)現(xiàn)小膠質細胞能夠促進腦微血管內皮細胞血管的生成。基于此,通過檢測血管生成相關基因mRNA的改變和蛋白質的改變,進一步檢測小膠質細胞對腦微血管內皮細胞

4、細胞遷移和增殖的改變,同時利用siRNA干擾的方法干擾小膠質細胞對腦微血管內皮細胞血管生成有所改變的基因,進一步研究其對血管生成的影響,期望從腦微血管的角度去分析AD的發(fā)病機制。
　　 方法：
　　 1、體外血管形成試驗檢測小膠質細胞上清對HBMEC形成血管的能力是否有影響。
　　 2、劃痕試驗檢測小膠質細胞上清對HBMEC細胞遷移能力的影響。
　　 3、WST試驗檢測小膠質細胞上清對HBMEC細胞增殖能

5、力的影響。
　　 4、ELISA試驗檢測小膠質細胞上清中TNF-a的分泌的情況。
　　 5、劃痕試驗檢測TNF-a對HBMEC細胞遷移能力的影響。
　　 6、WST試驗檢測TNF-a對HBMEC細胞增殖能力的影響。
　　 7、體外血管形成試驗檢測TNF-a對HBMEC形成血管能力的影響。
　　 8、Real-time PCR試驗檢測小膠質細胞上清對HBMEC形成血管生成相關基因mRNA水平上的改變

6、。
　　 9、Western blot試驗體外血管檢測小膠質細胞上清對HBMEC形成血管生成相關基因蛋白質水平上的改變。
　　 10、PCR方法對腦微血管內皮細胞中表達的血管生成相關基因的亞型進行分析,并克隆其全長至真核細胞表達載體。
　　 11、siRNA干擾試驗干擾小膠質細胞對腦微血管內皮細胞血管生成有所改變的基因,并用Western blot試驗進行鑒定。
　　 12、體外血管形成試驗檢測干擾后的H

7、BMEC其小膠質細胞上清促進血管腦微血管內皮細胞形成的能力是否有改變。
　　 結果：
　　 1、體外血管形成試驗結果顯示,小膠質細胞所分泌的上清能夠促進腦微血管內皮細胞血管的生成。
　　 2、劃痕試驗檢測小膠質細胞所分泌的上清組與10%FBSHG-DMEM對照組相比,HBMEC細胞的遷移能力上升。
　　 3、WST試驗檢測小膠質細胞所分泌的上清組與10%FBSHG-DMEM對照組相比,HBMEC細胞的增殖

8、能力下降。
　　 4、ELISA試驗檢測小膠質細胞上清中存在較高濃度的TNF-alpha。
　　 5、劃痕試驗檢測TNF-a能夠促進腦微血管內皮細胞的遷移。
　　 6、WST試驗檢測TNF-a對腦微血管內皮細胞的細胞增殖沒有影響。
　　 7、體外血管形成試驗結果顯示,TNF-alpha能夠促進腦微血管內皮細胞的血管生成。
　　 8、Real-time PCR試驗檢測小膠質細胞所分泌的上清組對HBM

9、EC形成血管生成相關基因ephrinA3、ephrinA4、KDR在mRNA水平上與10%FBSHG-DMEM對照組相比表達水平增高。
　　 9、Western blot結果顯示,小膠質細胞所分泌的上清組對HBMEC形成血管生成相關基因ephrinA3、ephrinA4、KDR在蛋白質水平上與10%FBSHG-DMEM對照組相比表達水平增高。
　　 10、PCR結果顯示,腦微血管內皮細胞中表達的血管生成相關基因ephri

10、nA4的亞型1和亞型2在腦微血管內皮細胞中表達,并成功克隆獲得ephrinA3、ephrinA4亞型1全長基因序列,并連接到真核細胞表達載體pcDNA3.1/myc-HisB。
　　 11、siRNA干擾試驗成功干擾小膠質細胞對腦微血管內皮細胞血管生成有所改變的基因ephrinA3、ephrinA4,并用Western blot試驗進行鑒定。
　　 12、體外血管形成試驗結果顯示,干擾后的HBMEC其小膠質細胞上清促進腦