白藜蘆醇抑制缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)背景及目的:
　　近幾年來(lái),隨著心血系統(tǒng)疾病治療策略的進(jìn)步以及溶栓術(shù)、血管成形術(shù)、冠脈搭橋術(shù)和器官移植等方法在臨床的應(yīng)用,使缺血的心臟組織重新得到血流灌注后,可使心臟結(jié)構(gòu)、功能得到恢復(fù)和改善;但有時(shí)心臟缺血后再灌注不僅使心臟功能不能恢復(fù),而且造成心肌組織結(jié)構(gòu)和功能障礙進(jìn)一步加重,甚至發(fā)生不可逆性損傷的現(xiàn)象稱(chēng)為心肌缺血/再灌注損傷(Myocardiumischemia/reperfusioninjury,MI/RI)。心肌缺血/

2、再灌注損傷可引起心肌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變、基質(zhì)中致密物增多,大量的鈣沉積、線(xiàn)粒體水腫、膜通透性改變和細(xì)胞器斷裂溶解等超微結(jié)構(gòu)的改變,這些是缺血心肌可逆性損傷向不可逆損傷的病理生理轉(zhuǎn)變過(guò)程。再灌后不但使心肌細(xì)胞發(fā)生上述的病理變化,同時(shí)導(dǎo)致心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Cardiacmicrovascularendothelialcell,CMEC)在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生異常的病理生理性改變,血管內(nèi)皮舒張因子(EDRF)減少和內(nèi)皮素(ET-1)增多,微血管

3、內(nèi)皮的水腫和破壞,致使血小板與白細(xì)胞黏附、聚集、栓塞,造成心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡(Apoptosis)或壞死。文獻(xiàn)報(bào)道,心肌缺血/再灌注損傷時(shí),心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)形態(tài)異常改變發(fā)生的時(shí)間早于心肌細(xì)胞[1],心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞受損引起活性氧物質(zhì)的生成,釋放細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、炎性組織因子、發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),從而加重內(nèi)皮細(xì)胞損傷、心肌組織結(jié)構(gòu)和功能障礙。
　　白藜蘆醇(Resveratrol)是廣泛存在于葡萄、藜蘆、虎杖等植

4、物中的一種多酚類(lèi)化合物,具有抗炎、抗氧化、抑制血小板黏附、聚集,調(diào)節(jié)能量代謝等生物學(xué)保護(hù)作用[2]。研究發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇可抑制缺血缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)心肌組織抵抗損傷的能力,維持氧供需平衡,促進(jìn)缺血心肌細(xì)胞的活力,改善心功能。近期研究證實(shí),磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號(hào)通路可參與缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞病理生理性損傷的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程,并調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、增殖分化、細(xì)胞遷移和能量代謝等生物學(xué)作用[3];

5、缺氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxiainduciblefactor-1α,HIF-1α)是缺氧環(huán)境下,廣泛存在于人體組織和哺乳動(dòng)物體內(nèi)的一種生存轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,通過(guò)調(diào)控一系列與適應(yīng)缺氧有關(guān)的基因的表達(dá),促進(jìn)氧轉(zhuǎn)運(yùn)、血管新生、抑制細(xì)胞凋亡、生存應(yīng)激和能量代謝等在保持機(jī)體內(nèi)氧穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要的生理學(xué)作用。
　　我們前期研究發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇可抑制缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[4],但是缺氧復(fù)氧前給予白藜蘆醇干預(yù)是否對(duì)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作

6、用及其作用機(jī)制否是與激活PI3K/Akt/HIF-1α信號(hào)通路有關(guān)尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。
　　研究目的:
　　1.觀察不同濃度的白藜蘆醇對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞活性和細(xì)胞凋亡的影響。
　　2.探討白藜蘆醇抑制缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是否通過(guò)激活PI3K/Akt/HIF-1α信號(hào)通路而實(shí)現(xiàn)的。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　第一部分:白藜蘆醇預(yù)處理對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響
　　1.取SD

7、雄性大鼠心臟的左心室心肌,利用酶消化法成功分離心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞(CMEC),Dil-Ac-LDL與DAPI免疫熒光雙染法鑒定細(xì)胞。
　　2.建立心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型,設(shè)立對(duì)照組、缺氧復(fù)氧組、不同濃度白藜蘆醇組(5、10、20、30、40μmol/L)。MTT比色法檢測(cè)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性,TUNE染色法檢測(cè)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,并確定白藜蘆醇最適實(shí)驗(yàn)濃度。
　　第二部分:PI3K/Akt/HIF-1α信號(hào)通

8、路在白藜蘆醇抑制缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用
　　體外培養(yǎng)2-3代的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞(CMEC),建立缺氧復(fù)氧細(xì)胞損傷模型,并隨機(jī)分為1)對(duì)照組2)缺氧復(fù)氧(H/R)組3)缺氧復(fù)氧(H/R)+20μmol/L白藜蘆醇組4)缺氧復(fù)氧(H/R)+20μmol/L白藜蘆醇+LY294002組。MTT比色法檢測(cè)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性;Transwell檢測(cè)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力;分別以PI-AnnexinV、TUN

9、EL染色法檢測(cè)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡;Western-blot法檢測(cè)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的P-Akt、HIF-1α蛋白表達(dá)水平。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞鑒定:細(xì)胞質(zhì)Dil-Ac-LDL染色陽(yáng)性(呈紅色熒光),細(xì)胞核DAPI染色陽(yáng)性(呈藍(lán)色熒光),證實(shí)體外所培養(yǎng)的細(xì)胞為心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞(CMEC)。
　　2.MTT、TUNEL法檢測(cè)結(jié)果表明:不同濃度(5、10、20、30、40μmol/L)白藜蘆醇均

10、可提高細(xì)胞活性,抑制細(xì)胞凋亡,中濃度的白藜蘆醇(20μmol/L)保護(hù)作用明顯(P<0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;故選定20μmol/L白藜蘆醇作為最適實(shí)驗(yàn)濃度。3.與對(duì)照組相比,缺氧復(fù)氧組P-Akt、HIF-1α蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05);與缺氧復(fù)氧組相比,白藜蘆醇組P-Akt、HIF-1α蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05);與白藜蘆醇組相比,缺氧復(fù)氧(H/R)+20μmol/L白藜蘆醇+LY294002組CMEC的活性、遷移

11、能力均明顯降低(P<0.05),細(xì)胞凋亡明顯增加(P<0.05),P-Akt、HIF-1α蛋白表達(dá)水平明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明白藜蘆醇抑制缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡可能與Ak磷酸化和上調(diào)HIF-1α蛋白表達(dá)水平有關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1.不同濃度的白藜蘆醇可增強(qiáng)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性、抑制細(xì)胞凋亡,而且在一定濃度范圍內(nèi)具有劑量依賴(lài)性。
　　2.白藜蘆醇可抑制心肌微血管內(nèi)