骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對脊髓損傷修復(fù)的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemesenchymalstemcells，BMSCs)有多向分化潛能，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)中具有良好的治療前景。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠脊髓損傷模型，研究BMSCs移植對損傷脊髓神經(jīng)功能恢復(fù)的影響，并從在體和離體兩方面探討B(tài)MSCs細(xì)胞移植的作用機(jī)制。 方法：1)脊髓損傷后7天，在損傷中心周圍移植BMSCs(BMSC組，n=20)或注射PBS(CON組，n=15)。采用BBB評分和斜坡實(shí)驗(yàn)評價(jià)大鼠脊髓功能

2、。對損傷脊髓進(jìn)行三維重建，測定脊髓空洞體積。采用Fastblue染色測定脊髓殘存白質(zhì)面積。2)采用綠色熒光蛋白(GFP)轉(zhuǎn)基因大鼠的BMSCs示蹤移植細(xì)胞，以進(jìn)一步觀察BMSCs移植后在脊髓中的存活情況，及其向神經(jīng)細(xì)胞分化的情況。3)采用透射電鏡觀察脊髓損傷中心軸突的數(shù)量。采用脊髓埋管模型，研究BMSCs移植對損傷脊髓軸突再生的影響。4)采用體外細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)，觀察BMSCs及其培養(yǎng)后的上清對脊髓神經(jīng)元突起生長的影響。5)采用RT-PC

3、R和細(xì)胞免疫熒光染色觀察膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)在BMSCs中的表達(dá)，ELISA測定BMSCs培養(yǎng)上清中GDNF和BDNF的濃度。觀察GDNF和BDNF抗體能否阻斷BMSCs對脊髓神經(jīng)元突起生長的促進(jìn)作用。 結(jié)果：1)從脊髓損傷后3W開始，BMSC組BBB評分顯著高于CON組。脊髓損傷8W時(shí)，BMSC組大鼠能站立的斜板角度明顯大于CON組。脊髓三維重建的結(jié)果表明，BMSC組脊髓空洞體積

4、明顯小于CON組。同時(shí)，BMSC組脊髓殘存白質(zhì)面積明顯大于CON組。2)細(xì)胞移植后4W，在脊髓損傷中心周圍可見大量BMSC-GFP細(xì)胞。免疫熒光染色結(jié)果表明，脊髓移植的BMSCs并不表達(dá)神經(jīng)元的表面標(biāo)志β-tubulinIII、星形膠質(zhì)細(xì)胞的表面標(biāo)志GFAP以及少突膠質(zhì)細(xì)胞的表面標(biāo)志RIP。3)電鏡下可見，在脊髓損傷中心BMSC組的軸突數(shù)量明顯多于CON組。脊髓埋管實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在種有BMSCs的導(dǎo)管內(nèi)可見有NF陽性神經(jīng)纖維的長入，而

5、對照組的導(dǎo)管內(nèi)未見神經(jīng)纖維。4)脊髓神經(jīng)元與BMSCs共培養(yǎng)后，其突起的長度、數(shù)量以及突起上的分叉數(shù)均較單獨(dú)培養(yǎng)組和DU145細(xì)胞對照組明顯增加。此外，BMSCs培養(yǎng)上清也具有增加脊髓神經(jīng)元突起長度和數(shù)量的作用。5)RT-PCR結(jié)果表明，BMSCs表達(dá)GDNFmRNA和BDNFmRNA。免疫熒光染色結(jié)果顯示，BMSCs的GDNF和BDNF染色均呈陽性。BMSCs培養(yǎng)上清中，GDNF和BDNF的濃度分別為70±5pg·mL-1和125±1

6、4pg·mL-1。在BMSCs培養(yǎng)上清中分別加入GDNF抗體和BDNF抗體后，脊髓神經(jīng)元的最長突起長度分別縮短了26％(P＜0.05)和24％(P＜0.05)，突起總長度分別縮短了34％(P＜0.05)和28％(P＜0.05)。在BMSCs培養(yǎng)上清中同時(shí)加入GDNF抗體和BDNF抗體后，脊髓神經(jīng)元的最長突起長度和突起總長度較單獨(dú)加入GDNF抗體和BDNF抗體時(shí)明顯縮短，但仍長于對照組。 結(jié)論：脊髓損傷后進(jìn)行BMSCs移植可促進(jìn)損