骨髓間充質(zhì)干細胞移植對大鼠放射性心臟損傷修復(fù)及其機制的研究.pdf

1、目的：放射治療（放療）是目前臨床治療多數(shù)惡性腫瘤的主要治療手段之一。然而，因為某些惡性腫瘤發(fā)生部位離縱膈較近（如肺癌、乳腺癌、縱膈淋巴瘤等），在放療的過程中心肌組織不可避免地會受到輻射影響。臨床研究表明，放射性心臟損傷多為胸部惡性腫瘤放射之后的長期并發(fā)癥，高劑量的射線照射會直接損傷冠狀動脈，放射性心臟損傷病理主要分為心包炎、心包纖維化、彌漫性心肌纖維化、冠狀動脈病變、微血管損傷及瓣膜狹窄。因此，放射性心臟損傷大大增加了胸部惡性腫瘤患者放

2、射治療后的死亡率。DNA損傷是放射損傷的一個主要形式，表現(xiàn)為DNA單鏈斷裂(SSB)和雙鏈斷裂(DSB)。雖然近年來心臟放射性損傷受到臨床越來越多的重視，但目前仍缺乏有效的治療手段，一些現(xiàn)有的藥物治療僅能改善癥狀。因此，我們致力于探索一種更加有效且創(chuàng)傷較小的治療方法。近來，間充質(zhì)干細胞(MSC)被廣泛引用于心臟疾病的治療。與其它干細胞相比（如胚胎干細胞及多能干細胞等），MSC除了具有自我更新、增殖及分化的修復(fù)重建能力以外，還具有歸巢并分

3、泌相關(guān)旁分泌因子間接修復(fù)損傷組織細胞的能力，而且MSC還具有來源廣泛、低致瘤性、低免疫原性和倫理爭議少等優(yōu)點。另外，體外實驗表明，MSC有一定的促進DNA損傷修復(fù)的能力，但是對于移植后能否促進大鼠心肌放射性DNA損傷修復(fù)沒有相關(guān)研究。本實驗研究骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSC)移植后對于大鼠放射性心臟損傷后心臟功能恢復(fù)、心臟炎癥和纖維化改變情況，并對BMSC移植后DNA損傷修復(fù)的機制進行探討。
　　方法：⑴BMSC提取、培養(yǎng):從4周齡大

4、小的雄性SD大鼠股骨中提取BMSC，用含10％FBS的F-12DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。⑵實驗動物建模:將78只大鼠隨機分為對照組（sham group6只）和X射線照射組（72只）。將大鼠麻醉后根據(jù)解剖結(jié)構(gòu)定位出心臟，用記號筆在體表做好標(biāo)記，放置于鼠板上固定四肢后放置于直線加速器下照射，共18Gy。⑶BMSC移植:將X射線照射組的72只大鼠隨機分為5組，單純照射組(IRR，12只)，照射后2周BMSC注射組（IRR+BMSC2W，15只），

5、照射后4周BMSC注射組（IRR+BMSC4W，15只），照射后6周BMSC注射組(IRR+BMSC6W，15只)，照射后8周BMSC注射組（IRR+BMSC8W，15只）。將eGFP熒光標(biāo)記的BMSC通過尾靜脈注射，每只注射1.5×106個細胞。⑷體重測定:照射后第二周開始，每周測定各組大鼠體重變化并記錄。⑸BMSC移植后存活情況觀察:各個BMSC注射組大鼠在給予尾靜脈注射一周后隨機處死3只，做心臟冰凍切片觀察GFP陽性BMSC遷徙及

6、存活情況，并進一步進行免疫組化染色觀察BMSC存活情況。⑹心臟功能測定:照射后第13周，所有大鼠置于心臟超聲下測定心臟功能變化情況。⑺HE染色:照射后第13周，所有剩余大鼠處死，取心臟組織，一部分制備成蠟塊，另一部分放入液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。將固定好的心臟組織修材、脫水、透明、包埋制成蠟塊。切片做常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察心臟組織在BMSC移植治療前、后的病理改變情況。⑻免疫組織化學(xué)染色:將蠟塊切成5μm的薄片，做PPAR-

7、α、PPAR-γ、TGF-β1、IL-6和IL-8免疫組化染色，顯微鏡下觀察其表達部位及表達量變化情況。⑼免疫熒光染色:將蠟塊切成5μm的薄片，做γ-H2AX免疫熒光染色，顯微鏡下觀察其表達部位及表達情況。⑽Real-time PCR:通過軟件設(shè)計XRCC4、DNA Ligase4、TP53BP1、SDF-1、CXCR4、IGF和VEGF引物;從冰凍的心臟組織中提取總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，在通過Real-time PCR進行擴

8、增，從分子水平上觀察各指標(biāo)表達情況。⑾Westem-blot:從冰凍的心臟組織中提取總蛋白，測定蛋白濃度后通過SDS-PAGE及轉(zhuǎn)膜、ECL發(fā)光等方法在蛋白水平上觀察XRCC4、DNA Ligase4、TP53BP1、SDF-1和CXCR4表達情況。⑿統(tǒng)計學(xué)方法:統(tǒng)計數(shù)據(jù)以mean+SD表示，用SPSS21.0版本軟件分析，組間比較用ANOVA方法分析，兩兩間比較用LSDt檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)果：①BMSC移

9、植可減輕大鼠放射心臟損傷后體重下降的程度:共有52只大鼠完成實驗，Sham組6只，IRR組8只，IRR+BMSC(2w)組8只，IRR+BMSC(4w)組10只，IRR+BMSC(6w)組10只，IRR+BMSC(8w)組10只。所有大鼠在飼養(yǎng)初期至照射后10周左右體重均呈現(xiàn)上升趨勢，在第10周開始，IRR組大鼠體重出現(xiàn)不同程度的下降，并持續(xù)下降至實驗終結(jié)（照射后第12周）。其它IRR+BMSC組大鼠體重均無明顯下降。②移植的BMSC可

10、遷徙至大鼠心臟損傷部位:通過冰凍切片鏡下觀察GFP陽性細胞及免疫組化進行GFP染色表明靜脈注射BMSC后可遷徙至心臟損傷部位，IRR+BMSC(6w)組及IRR+BMSC(8w) BMSC遷移數(shù)量更為明顯。③BMSC移植可改善放射性心臟損傷的心臟收縮功能及心肌肥厚程度:心臟超聲顯示BMSC移植后，IRR+BMSC組大鼠LVEF值較IRR組大鼠有不同程度改善，而各IRR+BMSC組大鼠的Ivsd及Lvpwd值較IRR組大鼠均有不同程度下降

11、。④BMSC移植后減輕大鼠放射性心臟損傷的心臟纖維化及炎癥程度:免疫組織化學(xué)染色顯示，與IRR組大鼠相比，各IRR+BMSC組大鼠中纖維化及炎性相關(guān)因子PPAR-α、PPAR-γ、TFG-β1、IL-6、IL-8表達不同程度減低，有統(tǒng)計學(xué)差異。⑤BMSC移植后促進放射性心臟損傷的心肌組織DNA損傷修復(fù):免疫熒光染色顯示，DNA損傷指標(biāo)γ-H2AX在各IRR組表達上調(diào)，提示照射后出現(xiàn)DNA損傷，與IRR組大鼠相比，各IRR+BMSC組大鼠

12、中γ-H2AX表達不同程度減低，而real-time PCR及western-blot顯示DNA損傷修復(fù)蛋白(NHEJ途徑)XRCC4、DNA LigaseⅣ及TP53BP1表達不同程度上調(diào)，有統(tǒng)計學(xué)差異。⑥BMSC移植后通過旁分泌機制促進DNA損傷修復(fù):real-time PCR及western-blot顯示，與IRR組大鼠相比，各IRR+BMSC組旁分泌因子SDF-1、CXCR4、VEGF表達不同程度上調(diào)，與DNA損傷修復(fù)蛋白表達趨