低頻電磁場促進骨髓間充質(zhì)干細胞移植修復(fù)大鼠脊髓損傷的實驗研究.pdf

1、背景和目的：脊髓損傷是由各種原因引起的脊髓結(jié)構(gòu)和功能的損傷，造成損傷平面以下運動、感覺、括約肌及植物神經(jīng)功能等障礙，引起的并發(fā)癥多，致殘率高，目前還沒有有效的治療方法。這主要是因為脊髓損傷后中樞神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境惡劣，不利于受損軸突的再生。因此，如何改善脊髓損傷后的不良微環(huán)境、提高脊髓中樞神經(jīng)再生能力，是治療脊髓損傷的關(guān)鍵。很多實驗證實，低頻電磁場具有促進細胞的增殖、生長和分化;減輕炎癥水腫、緩解疼痛;促進組織再生和減少細胞凋亡的作用。近來

2、研究還發(fā)現(xiàn)，低頻電磁場可以明顯改善貓和大鼠脊髓損傷模型的運動功能，該作用與低頻電磁場加快受損神經(jīng)的再生過程，并影響生長因子活性和表達水平從而有利于軸突運輸和神經(jīng)突的再生有關(guān)。隨著干細胞研究的深入，發(fā)現(xiàn)干細胞可在組織修復(fù)過程中發(fā)揮重要的作用。其中骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSC)具有多能干細胞特性，可以分化為骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞等細胞。研究已經(jīng)證實，在體內(nèi)外骨髓來源的細胞能形成神經(jīng)細胞系。而且研究者使用BMSC用于治療脊髓損傷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)B

3、MSC移植有助于提高肢體運動功能的恢復(fù)。我們課題組前期的研究顯示，低頻電磁場不僅可以促進體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖而且還具有促進其向功能性神經(jīng)元分化的作用。然而，低頻電磁場是否有助于改善脊髓損傷局部微環(huán)境及有助于BMSC移植修復(fù)脊髓損傷大鼠從而促進其運動功能的恢復(fù)，國內(nèi)外尚未見相關(guān)報道。因此，本實驗構(gòu)建不完全性脊髓損傷大鼠模型，探討低頻電磁場在移植骨髓間充質(zhì)干細胞大鼠脊髓損傷模型運動功能恢復(fù)中的作用。
　　 方法：采用全骨

4、髓培養(yǎng)法分離培養(yǎng)大鼠BMSC，觀察原代及傳代細胞的形態(tài)及生長特點;采用流式細胞術(shù)檢測細胞表面標志物和細胞周期對培養(yǎng)的BMSC進行鑒定。將第3-5代BMSC作為種子細胞，BrdU進行標識后用于移植。采用脊髓壓迫法構(gòu)建64只SD大鼠T10不完全性脊髓損傷模型，并隨機分成四組即對照組、BMSC組、EMF組和EMF+BMSC組，每組16只大鼠，造模后按時間點不同又分為3、7、14和21天四個亞組，每個亞組4只大鼠。脊髓損傷后30分鐘內(nèi)，用微量注

5、射器將BrdU標記的BMSC懸液注入到BMSC組和EMF+BMSC組大鼠脊髓損傷區(qū)頭、尾側(cè)脊髓實質(zhì)內(nèi)。脊髓損傷24小時后，將EMF組和EMF+BMSC組大鼠暴露在低頻電磁場（頻率為50 Hz，強度為5 mT）中，每天60分鐘，每天1次，連續(xù)作用21天;對照組和BMSC組置于無低頻電磁場的同樣的環(huán)境中觀察。術(shù)前及術(shù)后第3、7、14和21天，將各組大鼠置于90cm×120cm開放空間內(nèi)，雙人、雙盲采用Basso-Beattie-Bresna

6、han(BBB)運動評分標準對大鼠后肢運動功能觀察和評分并對其進行統(tǒng)計學(xué)分析。分別在第3、7、14和21天時每組處死4只大鼠留取標本，HE染色觀察各組損傷脊髓組織病理學(xué)變化情況;免疫組織化學(xué)法分析研究BrdU陽性BMSC在脊髓損傷區(qū)的生存情況;免疫熒光法檢測GFAP、MMP-2和BrdU陽性BMSC在脊髓損傷區(qū)的表達情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.利用脊髓壓迫法造模后立即出現(xiàn)一過性鼠尾痙攣性擺動和雙下肢抽動，術(shù)后1小時麻

7、醉清醒后大鼠BBB評分為0-2分;同時大腦皮層體感誘發(fā)電位顯示P1、N、P2波的峰潛伏期(Lat)延長，幅度幾乎為正常的2倍，說明成功構(gòu)建了不完全性脊髓損傷模型。
　　 2.分離BMSC后進行培養(yǎng)，BMSC形成細胞團簇，有較多突起，細胞呈現(xiàn)梭形外觀。流式細胞術(shù)細胞表面標志物鑒定提示培養(yǎng)的BMSC高表達CD90、CD29、CD44和CD73，而低表達CD45。第3代BMSC中G0/G1期的細胞為82.0％，G2期的細胞為1.46％

8、，S期的細胞為16.5％，大部分細胞處于靜止期，只有少數(shù)的細胞處于活躍的增殖期，符合干細胞特征。
　　 3.各脊髓損傷模型實驗前BBB評分結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異;實驗后經(jīng)重復(fù)測量方差分析，結(jié)果顯示組間存在差異(F=36.755，P=0.000)，四種不同處理的大鼠BBB評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義;不同時間點間也存在差異(F=374.025，P=0.000)，各組BBB評分變化與時間變化有關(guān)。實驗處理方法與時間之間有交互作用(F=7.471，

9、P=0.000)，提示處理因素隨時間的增加，BBB評分變化趨勢不同，EMF+BMSC組變化明顯。進一步分析單獨效應(yīng)結(jié)果顯示，第3天時各組大鼠后肢運動功能的BBB評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.941，P=0.177)，其余各時間點內(nèi)各組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均=0.000)。7天時，各組BBB評分均有提高，四組之間BBB評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=13.918，P=0.000)，但對照組與EMF組之間和BMSC組與EMF+BMSC組之

10、間的BBB評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義，分別為(P=0.240和P=0.472)。14天時，對照組與BMSC組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)，對照組與EMF組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001)，對照組與BMSC+EMF組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000); EMF組和BMSC組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.035)，EMF組和BMSC+EMF組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.004);但BMSC組和EMF+BMSC組之間BBB評分

11、差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.258)。21天時，對照組與BMSC組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)，對照組與EMF組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)，對照組與BMSC+EMF組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000); EMF組和BMSC組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.009)，EMF組和BMSC+EMF組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000); BMSC組和EMF+BMSC組之間BBB評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.005)。提

12、示BMSC移植和EMF治療均可改善大鼠脊髓損傷模型的運動功能，兩者相比BMSC組效果較明顯;但低頻電磁場干預(yù)和BMSC移植共同作用于脊髓損傷模型時，與其他實驗組相比較，EMF+BMSC組大鼠脊髓損傷模型后肢運動功能的恢復(fù)更快更好。
　　 4.術(shù)后第3天各組大鼠損傷脊髓組織結(jié)構(gòu)紊亂，局部有出血、水腫和壞死細胞形成。第7天，對照組和EMF組脊髓組織結(jié)構(gòu)破壞嚴重，損傷區(qū)有較多壞死液化吸收后形成的囊性空洞，神經(jīng)細胞明顯減少且變性、腫脹較

13、重，周圍有炎性細胞浸潤，組織進一步腫脹，血流減少;BMSC組和EMF+BMSC組損傷區(qū)囊性空洞面積較小、腫脹稍減輕，可見肥大的巨噬細胞和膠質(zhì)細胞等，組織結(jié)構(gòu)仍比較模糊。隨著時間變化，各組脊髓組織結(jié)構(gòu)逐漸改善，第14天，除了對照組外，其他三組囊性空洞幾乎閉合，被其它細胞組織所代替填充，BMSC組組織水腫消失，僅有少量炎細胞浸潤，EMF+BMSC組脊髓損傷結(jié)構(gòu)已大部分修復(fù)，細胞排列有序，炎細胞基本消失。術(shù)后第21天，除對照組外，其他各組損傷

14、脊髓組織結(jié)構(gòu)基本修復(fù)。
　　 5.第14天和21天時，對照組脊髓損傷區(qū)可見大量的GFAP陽性蛋白;EMF組和BMSC組可見中等量GFAP陽性蛋白分布于損傷區(qū)周圍;EMF+BMSC組GFAP陽性蛋白最少。BMSC組和EMF+BMSC組的脊髓組織在BMSC移植后第7天，局部組織MMP-2的表達量開始升高，14天最明顯。術(shù)后3～21天，BMSC組和EMF+BMSC組損傷脊髓組織中都可觀察到BrdU陽性細胞，并與組織融合生長，EMF+B