骨髓間充質干細胞移植修復慢性期脊髓損傷的基礎研究和轉化探索.pdf

1、目的：
　　建立與臨床相似的創(chuàng)傷性慢性期脊髓損傷（Spinal Cord Injury, SCI）大鼠模型，通過核磁共振彌散張量技術（Diffusion Tensor Imaging, DTI）和彌散纖維束示蹤成像技術（Diffusion Tensor Tracking, DTT）對動物模型和治療方法進行評估，創(chuàng)立核磁共振介導的大鼠創(chuàng)傷性脊髓空洞內定位移植的方法，進而探索骨髓間充質干細胞（Bone marrow derived m

2、esenchymal stem cells, BMSCs）移植修復慢性期脊髓損傷的療效、最佳劑量及其作用機制。
　　方法：
　　1.動物模型制作以PSI-IH Impactor制作大鼠脊髓T10挫裂傷模型，連續(xù)6w每周對實驗動物行BBB評分、核磁共振常規(guī)掃描、彌散張量成像和彌散纖維束示蹤成像檢測。
　　2.脊髓空洞內定位移植以慢性期SCI大鼠為對象，以Fe3O4磁性納米粒子為移植物，通過大鼠的體表定位，在MRI介導下分

3、別行2次獨立的8μl磁性納米粒子脊髓空洞內定位移植。
　　3. BMSCs分離培養(yǎng)采用全骨髓分離法分離培養(yǎng)BMSCs，應用流式細胞儀和光鏡下觀察對細胞進行鑒定。
　　4. BMSCs移植修復慢性期 SCI以脊髓空洞內定位移植的方法，分別將DMEM、4×105、8×105和1×106的BMSCs移植到慢性期SCI動物模型的損傷區(qū)域。移植后連續(xù)觀察8周，分別采用BBB評分和旋轉測試評估SCI大鼠功能恢復情況，采用樣品的肉眼觀察、

4、MRI常規(guī)T2掃描、DTT和DTI分析、免疫熒光、HE染色的方法分析大鼠局部損傷區(qū)域變化，通過對脊髓組織切片的MAP2、Nestin、Tublin、GFAP、VEGF和 BDNF的免疫熒光染色，探討分析不同濃度BMSCs對慢性期脊髓損傷后神經細胞修復、膠質瘢痕清除、血管重塑及營養(yǎng)因子旁分泌的作用。
　　結果：
　　1.成功建立大鼠慢性期SCI動物模型，本實驗中動物無死亡及感染跡象， SCI后1w、2w、3w、4w、5w、6w

5、的大鼠BBB評分為4.21±0.35、5.08±0.72、5.79±0.88、6.12±0.69、6.39±0.55、6.44±0.62，MRI常規(guī)掃描可見損傷區(qū)域膠質瘢痕清晰和髓內高信號液腔空洞，該空洞可分為3類即：中央型、分裂型、彌散型。
　　SCI后局部損傷區(qū)域和液腔空洞于SCI后1w、2w、3w、4w、5w、6w的體積分別為0 mm3、（0.21±0.35） mm3、（2.21±0.44） mm3、（3.18±0.82）

6、mm3、（3.27±0.79）mm3和（3.31±0.73）mm3。DTI分析提示，SCI后1w、2w、3w、4w、5w、6w損傷區(qū)域的 ADC值分別為（2351.91±780.73）×10-6mm2/s、（2033.22±720.11）×10-6mm2/s、（1972.10±710.31）×10-6mm2/s、（1604.22±720.51）×10-6mm2/s、（1550.62±656.11）×10-6mm2/s和（1549.71±

7、660.73）×10-6mm2/s，F(xiàn)A值分別為0.30±0.06、0.31±0.07、0.32±0.07、0.33±0.09、0.34±0.08和0.34±0.08。
　　2. MRI介導下完成損傷空洞內定位移植，SCI空洞體積由（5.71±0.21）mm3降低至（3.23±0.36）mm3，經過二次重復操作驗證后，脊髓空洞的體積由（3.23±0.36）mm3降低至（1.48±0.72）mm3，移植操作成功，并且該方法具有可重復

8、性。
　　3.經流式細胞儀篩查分析，BMSCs的免疫表型為：CD105、CD90和CD44陽性，CD45和CD34陰性，符合間充質干細胞的表型特征，并且提示細胞樣品中不存在造血系統(tǒng)的細胞污染。
　　4.順利完成細胞定位移植，移植后即刻進行MRI掃描可見移植物位于損傷中心。實驗動物無死亡、感染或致瘤跡象。大鼠功能恢復評估結果提示，相較DMEM組，細胞移植組均有不同程度的改善（p<0.05），1×106細胞組改善最為明顯。通過肉

9、眼觀察、MRI常規(guī)掃描、DTT和DTI分析、免疫熒光和HE染色分析對大鼠局部損傷區(qū)域的變化分析，結果提示，相較DMEM組，細胞移植組均有不同程度的改善（p<0.05），1×106細胞組改善最為明顯。脊髓組織切片的MAP2、Nestin、GFAP、Tublin、VEGF和BDNF的免疫熒光染色結果提示不同濃度BMSCs對慢性期SCI后神經細胞的修復、膠質瘢痕清除、血管重塑及營養(yǎng)因子旁分泌作用療效不同，其中1×106細胞組改善最為明顯。

10、r>　　結論：
　　大鼠慢性期脊髓損傷模型于傷后4w成熟，彌散張量成像技術和彌散纖維束示蹤成像是診斷和評估損傷程度及治療手段的高效量化方法，損傷局部骨髓間充質干細胞移植修復大鼠慢性期脊髓損傷是一種行之有效的修復手段。骨髓間充質干細胞可通過其在神經細胞修復、膠質瘢痕清除、血管重塑及營養(yǎng)因子旁分泌的作用機制對慢性期脊髓損傷進行多層面的修復，本研究結果提示骨髓間充質干細胞修復大鼠慢性期脊髓損傷最佳適用劑量為5×106細胞/kg，為骨髓間