內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)對移植性動(dòng)脈硬化的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、在過去的40年中,雖然器官移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)(acute rejection,AR)得到了有效的控制,但移植性動(dòng)脈硬化(transplantarteriosclerosis,TA)卻嚴(yán)重制約著移植受者的長期生存。移植性動(dòng)脈硬化的病理改變特點(diǎn)為移植物內(nèi)各級動(dòng)脈內(nèi)膜發(fā)生彌漫性、向心性增厚,引起管腔狹窄。早期病變主要表現(xiàn)為血管壁炎癥細(xì)胞的浸潤,晚期則主要以內(nèi)膜增厚,管腔狹窄為主。目前認(rèn)為,移植性動(dòng)脈硬化是免疫因素和多種非免疫因素共同造成的血

2、管內(nèi)膜反復(fù)損傷、修復(fù)的結(jié)果。但是,迄今為止,其確切的發(fā)病機(jī)制仍不清楚,因此,缺乏有效的預(yù)防和治療措施。
　　 內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells,EPCs)作為一類具有多種分化潛能、自我增殖等干細(xì)胞性質(zhì)的特殊細(xì)胞,在參與組織損傷、修復(fù)及血管形成中發(fā)揮重要作用,并與多種心血管疾病的發(fā)病密切相關(guān)。最近研究表明:EPCs參與移植性動(dòng)脈硬化發(fā)病過程。雖然,移植性動(dòng)脈硬化的確切發(fā)病機(jī)制尚未闡明,但是,近幾

3、年在EPCs研究領(lǐng)域所取得的諸多成果為探究移植性動(dòng)脈硬化的發(fā)病機(jī)制提供了新的思路和依據(jù)。大量研究顯示,移植性動(dòng)脈硬化患者外周血EPCs數(shù)量明顯減少,而且受體源性EPCs可以歸巢至移植物血管內(nèi)膜損傷部位,分化為內(nèi)皮細(xì)胞和/或血管平滑肌細(xì)胞并參與移植性動(dòng)脈硬化內(nèi)膜增生。但是,受體源性EPCs在移植性動(dòng)脈硬化發(fā)病中的具體作用,尚有爭議;EPCs歸巢至移植物血管內(nèi)膜增殖、分化為內(nèi)皮細(xì)胞具體機(jī)制,仍有待于做進(jìn)一步研究。因此,探討EPCs在移植性動(dòng)

4、脈硬化的具體作用及相關(guān)機(jī)制,不僅可望為揭示移植性動(dòng)脈硬化的發(fā)病機(jī)理提供重要線索,進(jìn)而為治療提供了新的方法。
　　 本研究首先通過同種異品系小鼠腹主動(dòng)脈移植建立移植性動(dòng)脈硬化模型,并用流式細(xì)胞儀檢測其外周血EPCs數(shù)量變化,探討EPCs數(shù)量動(dòng)態(tài)變化與移植性動(dòng)脈硬化病變之間的關(guān)系。繼之,將體外培養(yǎng)擴(kuò)增的骨髓源性EPCs輸入移植性動(dòng)脈硬化模型體內(nèi),觀察增加EPCs數(shù)量對移植性動(dòng)脈硬化的影響,探討受體源性EPCs在移植性動(dòng)脈硬化中的作用

5、。由于VEGFR-2可在EPCs表面表達(dá)并發(fā)揮重要作用,因此,在第三部分通過酪氨酸激酶抑制劑Vandetanib特異性阻斷VEGFR-2,觀察在體外條件下對骨髓單個(gè)核細(xì)胞向EPCs分化及對后者的生物學(xué)功能影響。最后,在小鼠腹主動(dòng)脈移植術(shù)后用Vandetanib進(jìn)行干預(yù),觀察Vandetanib影響EPCs數(shù)量及生物學(xué)功能情況,從而判斷其對移植動(dòng)脈硬化可能具有的抑制作用。
　　 第一部分小鼠移植性動(dòng)脈硬化模型的建立及外周血EPCs

6、數(shù)量動(dòng)態(tài)變化
　　 目的:建立小鼠移植性動(dòng)脈硬化模型,觀察移植性動(dòng)脈硬化病變過程中外周血EPCs數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化及意義。
　　 方法:以C57BL/6小鼠為供體,BALB/c小鼠為受體,建立同種異品系腹主動(dòng)脈移植模型。光鏡和電鏡觀察移植動(dòng)脈的病理改變,并采用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)分析術(shù)后2周、4周及6周移植血管內(nèi)膜增生情況。流式細(xì)胞儀檢測術(shù)前及術(shù)后1、3、7、14及28天外周血EPCs數(shù)量變化。
　　 結(jié)果:術(shù)后3天,

7、移植動(dòng)脈內(nèi)膜損傷并伴有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤。術(shù)后2周,觀察到移植動(dòng)脈內(nèi)膜增厚,術(shù)后4周、6周內(nèi)膜增生逐漸加重,移植動(dòng)脈管腔明顯狹窄。外周血EPCs數(shù)量術(shù)后早期增多,3天達(dá)到高峰,此后迅速減少,術(shù)后2周、4周顯著低于術(shù)前水平。
　　 結(jié)論:同種異品系小鼠(C57BL/6→BALB/c)腹主動(dòng)脈移植成功復(fù)制出移植性動(dòng)脈硬化的病變特點(diǎn),可用于移植性動(dòng)脈硬化發(fā)病機(jī)理和防治措施的研究。外周血EPCs數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化與移植性動(dòng)脈硬化病變密切相關(guān)

8、,可成為預(yù)測移植物動(dòng)脈硬化發(fā)病的新指標(biāo)。
　　 第二部分 輸入受體骨髓源性EPCs對移植性動(dòng)脈硬化的促進(jìn)作用
　　 目的:探討輸入體外培養(yǎng)擴(kuò)增的受體骨髓源性EPCs對移植性動(dòng)脈硬化的影響。
　　 方法:密度梯度離心法分離小鼠骨髓源性單個(gè)核細(xì)胞,并以貼壁培養(yǎng)法誘導(dǎo)培養(yǎng)EPCs。采用C57BL/6小鼠為供體,BALB/c小鼠為受體,通過同種異品系腹主動(dòng)脈移植建立小鼠移植性動(dòng)脈硬化模型。EPCs移植組移植術(shù)后通過尾靜脈

9、輸入EPCs,對照組則注入相應(yīng)體積的生理鹽水。同時(shí)將CM-DiI標(biāo)記的:EPCs移植給受體小鼠,進(jìn)行EPCs移植后體內(nèi)示蹤。術(shù)后2、4周處死受體小鼠,觀察各組移植動(dòng)脈的病理改變,用掃描電鏡和Evans blue染色方法評價(jià)術(shù)后14天內(nèi)皮損傷修復(fù)情況;并用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)測量術(shù)后4周移植動(dòng)脈內(nèi)膜增生情況。
　　 結(jié)果:骨髓源性單個(gè)核細(xì)胞體外可誘導(dǎo)培養(yǎng)出EPCs,表現(xiàn)為其細(xì)胞表面既表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記(Sca-1),也表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞特異性

10、標(biāo)記(Flk-1,CD31,vWf等),并具有內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)功能。CM-DiI標(biāo)記的EPCs移植后主要定位于移植動(dòng)脈損傷內(nèi)膜部位。術(shù)后2周,EPCs移植組移植動(dòng)脈內(nèi)皮損傷較對照組明顯加重。術(shù)后4周,EPCs移植組移植動(dòng)脈新生內(nèi)膜厚度較對照組明顯增加,管腔狹窄程度顯著加重。
　　 結(jié)論:EPCs參與移植動(dòng)脈新生內(nèi)膜形成,受體骨髓源性EPCs可加重移植動(dòng)脈內(nèi)膜損傷,對移植性動(dòng)脈硬化起促進(jìn)作用。
　　 第三部分Vandeta

11、nib對EPCs數(shù)量和生物學(xué)功能的抑制作用及機(jī)制
　　 目的:檢測VEGFR-2在EPCs中的表達(dá),并觀察VEGFR-2抑制劑Vandetanib對骨髓單個(gè)核細(xì)胞向EPCs分化以及EPCs增殖、黏附和遷移等生物學(xué)功能的抑制作用及機(jī)制。
　　 方法:采用密度梯度離心法從小鼠骨髓獲取單個(gè)核細(xì)胞,將其接種在纖維連接素包被的培養(yǎng)板,加入不同濃度Vandetanib,培養(yǎng)7天后,在倒置熒光顯微鏡下對EPCs進(jìn)行計(jì)數(shù),觀察Vande

12、tanib對骨髓單個(gè)核細(xì)胞向EPCs分化的影響。收集誘導(dǎo)培養(yǎng)7天的EPCs,按不同Vandetanib干預(yù)濃度進(jìn)行分組,分別用細(xì)胞計(jì)數(shù)、MTT比色法、改良的Boyden小室及黏附能力測定檢測Vandetanib對EPCs增殖、遷移和黏附能力的影響。Western blotting法檢測EPCs在不同濃度Vandetanib干預(yù)后VEGFR-2和pVEGFR-2,Akt和pAkt,Erk和pErk等蛋白表達(dá)變化。
　　 結(jié)果:Va

13、ndetanib顯著抑制骨髓單個(gè)核細(xì)胞向EPCs分化。Vandetanib對EPCs的增殖、黏附和遷移能力也有明顯抑制作用,并具有濃度和時(shí)間依賴性。Western blotting法檢測結(jié)果顯示EPCs表達(dá)VEGFR-2,VEGF可刺激EPCs VEGFR-2的磷酸化。Vandetanib能阻斷VEGF誘導(dǎo)的EPCs VEGFR-2的活化,并降低其下游信號分子Akt及Erk磷酸化水平。
　　 結(jié)論:Vandetanib可阻止骨髓

14、單個(gè)核細(xì)胞向EPCs分化,并明顯抑制EPCs的增殖、黏附及遷移等生物學(xué)功能。Vandetanib的這一作用可能與直接阻斷VEGFR-2的活化及下游Akt和Erk信號通路有關(guān)。
　　 第四部分:vandetallib抑制EPCs對移植性動(dòng)脈硬化的影響
　　 目的:觀察VEGFR-2抑制劑Vandetanib對小鼠移植動(dòng)脈模型外周血EPCs數(shù)量的抑制作用及移植動(dòng)脈新生內(nèi)膜形成的影響,探討Vandetanib具有抗移植性動(dòng)脈硬

15、化作用及可能機(jī)制。
　　 方法:采用C57BL/6小鼠為供體,BALB/c小鼠為受體,建立同種異品系腹主動(dòng)脈移植模型。術(shù)后將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為3組:①移植對照組;②Vandetanib小劑量干預(yù)組(25mg/kg.d);③Vandetanib大劑量干預(yù)組(100mg/kg.d)。流式細(xì)胞儀分別檢測術(shù)前及術(shù)后1、3、7、14及28天外周血EPCs數(shù)量變化;掃描電鏡和Evans blue染色方法評價(jià)術(shù)后14天內(nèi)皮損傷修復(fù)情況;光鏡下觀

16、察各組移植動(dòng)脈術(shù)后4周的病理改變,并用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)分析移植動(dòng)脈新生內(nèi)膜增生情況。
　　 結(jié)果:Vandetanib明顯降低腹主動(dòng)脈移植術(shù)后早期外周血EPCs數(shù)量,術(shù)后2周、4周外周血EPCs數(shù)量仍維持在較低水平,其中大劑量干預(yù)組EPCs數(shù)量減少更加顯著。術(shù)后2周,掃描電鏡和Evans blue染色均提示Vandetanib干預(yù)組移植動(dòng)脈內(nèi)皮損傷較對照組減輕。移植術(shù)后4周,Vandetanib大劑量干預(yù)組移植動(dòng)脈內(nèi)膜增生厚度