血管內(nèi)皮祖細(xì)胞移植對損傷動脈再內(nèi)皮化和內(nèi)膜增生的作用及川芎嗪對其的影響.pdf

1、目的:探討血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)移植在球囊損傷后血管再內(nèi)皮化及抑制新生內(nèi)膜增生中的作用及川芎嗪(TMP)的使用增強(qiáng)EPCs對損傷動脈內(nèi)皮的修復(fù)，抑制平滑肌細(xì)胞(VSMC)和內(nèi)膜的增生，降低管腔狹窄度效應(yīng)，為冠脈介入術(shù)后再狹窄的治療提供一種新的手段，并為TMP的開發(fā)提供新的作用點(diǎn)。 方法:1.細(xì)胞分離培養(yǎng)和鑒定:選取3月齡新西蘭大白兔一只，連續(xù)3天皮下注射G-CSF30

2、ug/d,抽取兔外周血25ml，用PBS將肝素抗凝血稀釋一倍，將稀釋血用Ficoll梯度密度離心，取中間白膜層的有核細(xì)胞，加入PBS，離心，洗滌兩次。用含20％的胎牛血清、20ng/mlVEGF的1640培養(yǎng)液懸浮，接種于25ml的玻璃培養(yǎng)瓶中。待細(xì)胞長至80％融合時(shí)，進(jìn)行傳代。培養(yǎng)至14天后免疫組化法鑒定細(xì)胞。待細(xì)胞增殖到移植所需的數(shù)量時(shí)，換用含20umol/L/DAPI的培養(yǎng)液，培養(yǎng)6小時(shí)，消化收集細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基沈滌兩次，用無血

3、清培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，以備移植。2.建立兔腹主動脈內(nèi)皮損傷模型及EPCs的血管內(nèi)移植:23只新西蘭大白兔，雌雄不拘，體質(zhì)量2.0-2.5KG(瀘州醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供)，隨機(jī)分為對照組(A組)、單純內(nèi)皮祖細(xì)胞移植組(B組)、川芎嗪干預(yù)移植組(C組)共三組，A組7只，B組和C組每組8只。川芎嗪干預(yù)移植組動物術(shù)前3天開始經(jīng)腹腔注射川芎嗪40mg/kg直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，單純內(nèi)皮祖細(xì)胞移植組和對照組給與腹腔注射等容積的生理鹽水。 模擬冠

4、狀動脈介入治療的方法建立兔腹主動脈內(nèi)皮損傷模型，2％戊巴比妥鈉30mg/kg過耳緣靜脈麻醉滿意后，分離兔左頸總動脈，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，用20G的靜脈留置針穿刺頸總動脈，全身肝素化，DSA數(shù)字減影X光引導(dǎo)下置入PTCA鋼絲至腹主動脈，用3.5mm×20mm的球囊以6個(gè)大氣壓擴(kuò)張，反復(fù)拉脫3次，行腹主動脈造影。造影完畢后，將球囊導(dǎo)管前端1/5置于球囊損傷動脈段上部，阻斷血流，造影見血流完全阻斷，行血管內(nèi)移植，維持球囊擴(kuò)張5分鐘，對照組灌注無血清培

5、養(yǎng)基，方法同上。退出導(dǎo)管，結(jié)扎近心端，縫合切口，術(shù)后每天肌注青霉素40萬u/只，連續(xù)3天。3.組織學(xué)檢查腹腔內(nèi)注射過量的戊巴比妥鈉處死動物，分離目標(biāo)段腹主動脈，4％多聚甲醛固定過夜。取標(biāo)本中1/3段，脫水包埋于石蠟中，切成5um的橫切片，常規(guī)行HE染色，相鄰切片行抗a-actin和抗CD31免疫組化染色切片，在400倍光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，記數(shù)新生內(nèi)膜層細(xì)胞核，a-1actin定位于血管平滑肌細(xì)胞胞漿內(nèi)，以a-actin免疫染色陽性細(xì)

6、胞占全體細(xì)胞數(shù)的百分比表示平滑肌細(xì)胞增殖指數(shù)，以CD31陽性細(xì)胞占管腔內(nèi)膜面積的百分比表示再內(nèi)皮化指數(shù)。HE巳染色切片，在BI-2000圖像分析系統(tǒng)上分別測定動脈內(nèi)膜、中膜厚度及管腔截面積，以(1-狹窄處管腔面積/原管腔面積)×100表示管腔狹窄度。使用SPSS14.0軟件包，所得數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析(ONE WAY ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，兩兩比較采用LSD法，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果:本

7、實(shí)驗(yàn)中觀察到，兔腹主動脈去內(nèi)皮損傷后，在14d時(shí)A組、B組和C組內(nèi)膜增殖厚度的情況分別是內(nèi)膜52.2±8.1um、33.3±5.6um、20.6±3.6um，中膜厚度分別是104.0±11.5um、73.4±8.7um、57.0±6.5um，在方差齊的情況下EPCs移植組的內(nèi)膜及中膜厚度顯著低于對照組，分別是33.3±5.6umVS 52.2±8.1um和73.4±8.7um VS104.0±11.5um(P<0.01)。在方差齊的情況

8、下內(nèi)皮祖細(xì)胞移植組的平滑肌細(xì)胞增殖指數(shù)明顯低于對照組(25.21％±5.30％VS 32.62％±7.20％，P<0.01)，管腔狹窄度明顯低于對照組(14.54％±4.08％VS 26.81％±5.56％，P<0.01)，再內(nèi)皮化指數(shù)明顯高于對照組(20.51±0.15％VS 58.58％±0.29％.P<0.01)。使用川芎嗪的EPCs移植組比單純EPCs移植組內(nèi)膜、中膜厚度，管腔狹窄度及血管平滑肌細(xì)胞增殖指數(shù)均明顯減低，而再內(nèi)皮化

9、指數(shù)明顯高于單純EPCs移植組(與單純EPCs組比較P<0.01)。 結(jié)論:血管內(nèi)EPCs移植具有抑制受損血管的內(nèi)膜和中膜生成，加快損傷動脈內(nèi)皮修復(fù)，抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和降低管腔狹窄度的作用。而使用川芎嗪的EPCs移植組比單純EPCs移植組內(nèi)膜、中膜厚度，平滑肌細(xì)胞增殖指數(shù)及管腔狹窄度減低，而再內(nèi)皮化指數(shù)增高，說明EPCs移植有加快損傷動脈內(nèi)皮修復(fù)的作用，川芎嗪具有加強(qiáng)其抑制內(nèi)膜增生和血管平滑肌細(xì)胞增殖，降低管腔狹窄度的作用