內(nèi)皮祖細胞移植延緩進展性局灶節(jié)段性腎小球硬化的實驗研究.pdf

1、本研究擬采用文獻報道的改良阿霉素腎病誘導(dǎo)的FSGS模型，即單側(cè)腎切除后分次注射阿霉素，如果不給予其他干預(yù)措施，動物將在腎切除和注射阿霉素后12-16周發(fā)展為FSGS。在本實驗中阿霉素第二次注射后1周，即FSGS的進展過程中，將體外培養(yǎng)的EPCs移植，依賴EPCs的“歸巢”特性使EPCs向受損的大鼠腎臟歸巢，觀察其對FSGS的進展是否有延緩作用。由于VEGF的半衰期僅30-40分鐘，直接補充VEGF的作用時間非常短暫，而且全身使用有諸多問

2、題包括增加腫瘤風(fēng)險、濃度不能維持以及價格昂貴等，因而將VEGF165重組腺病毒在體外構(gòu)建并轉(zhuǎn)染培養(yǎng)獲得的EPCs再移植給阿霉素誘導(dǎo)的進展期FSGS大鼠，EPCs在體內(nèi)修復(fù)足細胞等細胞損傷的同時，持續(xù)合成分泌VEGF165，觀察轉(zhuǎn)染VEGF165的EPCs對FSGS進展是否比單用EPCs有更好的延緩作用，探討‘EPCs移植和VEGFl65轉(zhuǎn)染：EPCs移植在’FSGS進展中的作用和可能機制，為臨床采用EPCs移植和VEGF轉(zhuǎn)染EPCs移植

3、治療FSGS的設(shè)想提供實驗依據(jù)。 主要實驗方法及結(jié)果： 1.大鼠骨髓來源的內(nèi)皮祖細胞的分離、體外誘導(dǎo)培養(yǎng)及鑒定 采用密度梯度離心法從雄性SD大鼠骨髓中得到單個核細胞，在特定的條件下進行分離純化，通過貼壁法培養(yǎng)、體外擴增獲取貼壁細胞，采用流式細胞表型檢測、免疫細胞化學(xué)及免疫雙熒光等方法進行鑒定。結(jié)果證實，通過此方法獲得的細胞即是EPCs，為EPCs移植作好了準備。采用雄性大鼠EPCs的目的是將雄性大鼠特有的Y染色體

4、作為外源性EPCs的標記。 2.腺病毒介導(dǎo)的VEGF165基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細胞的實驗研究 用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ+HindⅢ從質(zhì)粒載體中切出VEGF165基因片段，與KpnⅠ +HindⅢ雙酶切的pAdTrack-CMV形成轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pAdTrack-CMV-VEGF165，PmeⅠ酶切線性化后與腺病毒基因組質(zhì)粒pAdEasy-1共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183，并在293細胞中包裝成Ad-VEGF165，PCR和West

5、ernBlot法鑒定目的蛋白表達。貼壁法體外培養(yǎng)獲得大鼠骨髓來源的EPCs(同前)，Ad-VEGF165體外轉(zhuǎn)染EPCs，檢測轉(zhuǎn)染后目的基因蛋白表達情況。 結(jié)果顯示：利用CsC12法由pAdqTrack-VEGF165和pAdEasy-1共轉(zhuǎn)化BJ5183感受態(tài)菌，可獲得陽性重組體細菌克隆。PCR和WesternBlot以及基因測序分析進行鑒定，表明重組腺病毒已含有目的基因，并能夠高效表達目的蛋白，序列正確；病毒滴度為1.4×1

6、010pfu/ml。Ad-VEGF165基因轉(zhuǎn)染培養(yǎng)第6d的EPCs后24h開始培養(yǎng)上清中VEGF蛋白表達顯著增加。證實體外構(gòu)建VEGF165重組腺病毒成功并且可以成功轉(zhuǎn)染EPCs，EPCs合成和分泌VEGF顯著增加，為VEGF165轉(zhuǎn)染EPCs移植到動物的在體實驗提供了基礎(chǔ)。 3.內(nèi)皮祖細胞移植或VEGF165基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細胞移植對進展性FSGS的進展的影響 雌性SD大鼠隨機分為正常對照組(對照組)、阿霉素腎病組(腎

7、病組)、EPC移植組(EPC組)和VEGF轉(zhuǎn)染EPCs后移植組(VEGF組)。腎病組、EPC組和VEGF組行單腎切除，術(shù)后1w和2w分別尾靜脈注射阿霉素制作阿霉素誘導(dǎo)的FSGS，對照組假手術(shù)并在相同時間點注射生理鹽水。于第二次注射阿霉素后1w，5Gy的X線全身照射后，EPC組尾靜脈注射移植1×106的EPCs，VEGF組尾靜脈注射移植1×106轉(zhuǎn)染了VEGF165重組腺病毒的EPCs，對照組和腎病組僅行同等劑量的X線照射和生理鹽水注射。

8、在切腎前(0w)和切腎后的第4(即EPCs移植后1w)、8、12、16w測大鼠體重、尿蛋白，處死大鼠取血測血清肌酐(SCr)、白蛋白(ALB)，原位雜交法觀察腎組織中Y染色體陽性細胞摻入情況，以證實雄性供鼠來源的EPCs到達并整合入雌性受鼠的腎組織中；觀察腎臟超微結(jié)構(gòu)和組織學(xué)變化，圖像分析計算腎小球硬化指數(shù)、腎小球毛細血管袢管腔開放程度及毛細血管袢截面積，同時免疫組化和WesternBlot檢測腎組織中VEGF的表達，并檢測與細胞外基質(zhì)

9、(Extracellularmatrix，ECM)代謝關(guān)系非常密切的轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforminggrowthfactorβ1，TGFβ1)和多種腎臟固有細胞向肌成纖維細胞表型轉(zhuǎn)化的標志性蛋白α-平滑肌肌動蛋白(α-smoothmuscleactin，α-SMA)在腎組織中的表達，作為各組腎組織慢性化轉(zhuǎn)化程度的指標。 結(jié)果顯示：(1)原位雜交的結(jié)果證實雄性大鼠來源的EPCs到達并整合到雌性阿霉素腎病大鼠的腎臟組織中，

10、而且這種整合從移植后1w直到實驗終點，但有逐漸減弱趨勢。整合的部位位于腎小球內(nèi)和腎小管上皮細胞。(2)腎病組大鼠的一般情況最差，次第為EPC組、VEGF組，對照組一般情況較好，一般情況包括大鼠精神、進食和體重。(3)實驗室檢查：EPC組和VEGF組從第4w開始尿蛋白即顯著低于腎病組，在第8w和第12wVEGF組尿蛋白顯著低于EPC組(p＜0.05)；SCr測定顯示，EPC組從第8w開始SCr顯著低于腎病組，VEGF組SCr從第4w開始顯

11、著低于腎病組，至第16w時有所增高，但顯著低于腎病組和EPC組；ALB結(jié)果顯示，EPC組的ALB從第4w開始下降，各時間點均顯著低于對照組，但第12、16w時顯著高于腎病組；VEGF組的結(jié)果與EPC組的結(jié)果相似，但在12w和16w，VEGF組ALB顯著高于EPC組(p＜0.05)。這些結(jié)果提示EPCs移植參與了EPC組和VEGF組尿蛋白下降、腎功能異常出現(xiàn)時間的延后以及血清ALB提高。(4)腎臟組織學(xué)和圖像分析的結(jié)果顯示，第16w時EP

12、C組和VEGF組腎小球毛細血管管腔開放程度顯著高于腎病組，且VEGF組顯著高于EPC組，VEGF組的毛細血管腔開放最好；毛細血管袢截面積的結(jié)果與。腎小球毛細血管腔開放程度的結(jié)果相似，系膜基質(zhì)相對含量也顯示EPC組和VEGF組較腎病組顯著降低，VEGF組又顯著低于EPC組；腎病組腎小球硬化指數(shù)顯著高于EPC組和VEGF組，而VEGF組的腎小球硬化指數(shù)最低。(5)透射電鏡觀察腎組織超微結(jié)構(gòu)的結(jié)果顯示：EPC組和VEGF組腎小球足細胞損傷修復(fù)

13、和腎小管上皮細胞損傷的減輕均早于腎病組，而VEGF組修復(fù)出現(xiàn)的時間更早。(6)免疫組化染色和WesternBlot分析顯示：EPC組和VEGF組的腎組織VEGF表達較對照組和腎病組明顯增強，直到實驗終點；VEGF組腎組織的VEGF表達較EPC組更強，VEGF蛋白表達也證實此結(jié)果；腎病組、EPC組和VEGF組腎組織TGF-β1、α-SMA的表達均隨實驗時間的延長逐漸增強，但EPC組和VEGF組較同時間點的腎病組明顯減弱，而VEGF組的表達

14、最弱；其蛋白表達也證實此結(jié)果。 結(jié)論： 1.采用密度梯度離心法收集骨髓中的單個核細胞，在特定的誘導(dǎo)條件下通過貼壁培養(yǎng)可以獲取足夠數(shù)量的EPCs，在短時間內(nèi)可在體外擴增，并最終在體外分化為有功能的具有內(nèi)皮細胞特異性標志物的成熟血管內(nèi)皮細胞。 2.采用DNA重組技術(shù)成功構(gòu)建了Ad-VEGF165重組腺病毒，且Ad-VEGF165能高效、穩(wěn)定地表達VEGF165目的基因且具有良好的安全性；構(gòu)建的Ad-VEGF165能夠