內(nèi)皮祖細(xì)胞移植在膿毒癥大鼠中的作用研究.pdf

1、目的:探討EPCs移植在LPS引起的大鼠sepsis中的治療作用，探究內(nèi)皮組細(xì)胞對sepsis靶向治療的分子生物學(xué)機(jī)制提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　方法:采用密度梯度離心法分離SD大鼠的骨髓EPCs，接種在含20％優(yōu)質(zhì)胎牛血清的DMEM-F12完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)5代后采用流式細(xì)胞儀鑒定表面標(biāo)記物CD133、CD34的表達(dá)，免疫熒光檢測內(nèi)皮祖細(xì)胞特異性抗原CD133、CD34的表達(dá)。綠色熒光蛋白腺病毒轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行內(nèi)皮祖細(xì)胞熒光標(biāo)記，活體

2、成像儀檢測及冰凍切片檢測組織中標(biāo)記熒光的EPCs在體內(nèi)的表達(dá)。大鼠隨機(jī)分為4組:正常對照組、內(nèi)皮祖細(xì)胞組(EPCs組)、膿毒癥模型組(LPS組)和內(nèi)皮祖細(xì)胞移植治療組（LPS+EPCs組），膿毒癥模型通過LPS靜脈給藥誘導(dǎo)，EPC移植組大鼠經(jīng)尾靜脈注入熒光標(biāo)記EPCs懸液(EPCs2×106/0.5ml)。分別于移植后1、7天取肺、肝及腎組織，采用冰凍切片檢測組織中標(biāo)記熒光的EPCs表達(dá);檢測各組織干/濕比值(W/D)，采用HE染色評估

3、病理改變;采用ELISA法檢測炎癥因子IL-6、IL-10;采用Real-time PCR法檢測肝、腎及肺組織TLR4的mRNA表達(dá)。
　　結(jié)果:培養(yǎng)的細(xì)胞在胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天后能形成圓形、梭形的細(xì)胞表型，10-14d細(xì)胞可鋪滿整個(gè)瓶底，光鏡下可見鋪路石樣改變。采用流式細(xì)胞儀測到培養(yǎng)的細(xì)胞CD133、CD34的雙標(biāo)記陽性率為99.0％，激光掃描共聚焦顯微鏡雙熒光染色試驗(yàn)顯示培養(yǎng)的細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)特異性抗原CD133、CD

4、34。證明EPCs培養(yǎng)成功。應(yīng)用已標(biāo)記綠色熒光蛋白的EPCs移植膿毒癥大鼠后，熒光成像顯示1d后EPCs主要集中在胸腹部，并持續(xù)到第7d。冰凍組織切片熒光顯微鏡檢測肺、肝及腎組織血管附近熒光分別較強(qiáng)，d7的組織標(biāo)本熒光比d1均明顯增強(qiáng)。EPCs移植可顯著減輕膿毒癥大鼠肺、肝及腎組織炎癥細(xì)胞的浸潤、細(xì)胞損傷，降低組織的W/D比值;降低炎癥因子IL-6、IL-10表達(dá)，恢復(fù)促炎癥反應(yīng)及抑炎反應(yīng)平衡;同時(shí)下調(diào)肺、肝及腎組織TLR4 mRNA的

5、表達(dá)。
　　結(jié)論:1、采用密度梯度離心法，經(jīng)體外培養(yǎng)、鑒定，成功分離出大鼠的骨髓EPCs;2、EPC靜脈移植后能成功到達(dá)損傷大鼠的肺、肝及腎組織。3.LPS誘導(dǎo)的膿毒癥大鼠模型中EPCs移植可顯著緩解肺、肝及腎組織損傷，修復(fù)了損傷的血管從而通過減少炎性細(xì)胞滲出和粘附，減輕了炎癥應(yīng)答;通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，下調(diào)了促炎癥反應(yīng)的應(yīng)答，使機(jī)體恢復(fù)促炎—抗炎平衡。4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明EPC移植能改善LPS誘導(dǎo)的大鼠臟器損傷，為膿毒癥治療提供了新的思