ghrelin對(duì)動(dòng)脈硬化內(nèi)皮細(xì)胞作用的臨床和基礎(chǔ)研究.pdf

1、背景和目的:以動(dòng)脈粥樣硬化(atheroselerosis，動(dòng)脈粥樣硬化)為主要病理改變的心腦血管疾病嚴(yán)重威脅著人類(lèi)健康。雖然眾多科學(xué)家傾注了大量的心血進(jìn)行研究，但是，由于動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前對(duì)其發(fā)病機(jī)制仍然存在許多未解難題。
　　Ghrelin是一種由28個(gè)氨基酸組成的多肽，最早在胃的組織中被發(fā)現(xiàn)，后續(xù)研究認(rèn)為它是生長(zhǎng)激素的內(nèi)源性配體，能夠刺激生長(zhǎng)激素分泌和增加攝食并減少脂肪利用，最終形成正能量平衡。最近研究發(fā)現(xiàn)，gh

2、relin除上述作用外，由于其本身及其受體在心血管系統(tǒng)的廣泛分布，而被認(rèn)為與心血管疾病存在某種聯(lián)系。基礎(chǔ)研究大多認(rèn)為ghrelin對(duì)心血管具有保護(hù)作用，但是臨床研究的結(jié)果卻缺乏一致性，有部分研究發(fā)現(xiàn)外周血ghrelin水平與動(dòng)脈粥樣硬化程度指標(biāo)——頸動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度(CIMT)呈負(fù)相關(guān)，既ghrelin是動(dòng)脈粥樣硬化的保護(hù)因素，而另外的研究卻提示ghrelin與CIMT呈正相關(guān)關(guān)系或無(wú)關(guān);并且目前尚未見(jiàn)ghrelin與動(dòng)脈硬度指標(biāo)——脈

3、搏波速度(PWV)關(guān)系的臨床研究報(bào)告?；谏鲜銮闆r，本研究首先對(duì)老年代謝綜合征患者的資料進(jìn)行分析，并引入PWV評(píng)價(jià)大動(dòng)脈僵硬度，綜合評(píng)價(jià)血管情況，來(lái)闡述ghrelin水平與動(dòng)脈硬化的關(guān)系。
　　關(guān)于ghrelin與動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制研究方面，由于氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，oxLDL)在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用非常重要，其可通過(guò)多種途徑促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，其中誘導(dǎo)血管內(nèi)皮

4、細(xì)胞凋亡為其初始作用之一;再有，內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和凋亡被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化形成的始動(dòng)環(huán)節(jié)，并在其發(fā)展中起重要作用，與其他因素相互協(xié)同、相互影響，促進(jìn)了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，所以，本研究的基礎(chǔ)研究部分，利用oxLDL誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)凋亡過(guò)程中加入ghrelin干預(yù)，并在此基礎(chǔ)上加用LY294002(PI3K阻滯劑)，PD98059（ERK1/2阻滯劑），以期分析其可能的細(xì)胞信號(hào)通路。
　　臨床研究部分:
　　

5、方法:本研究為橫斷面研究。2011年4月到2012年4月在我院就診的年齡＞60歲的老年患者5789人中篩選所有符合入選標(biāo)準(zhǔn)并同意參加本研究的代謝綜合征患者142例為代謝綜合征組(MS)。代謝綜合征符合2004年中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病分會(huì)提出的CDS診斷標(biāo)準(zhǔn)。另外篩選性別、年齡匹配的非代謝綜合征老年人66例為對(duì)照組。測(cè)量身高、體重、血壓等臨床參數(shù)，并抽血檢測(cè)ghrelin、血脂、血糖等生化指標(biāo)，同時(shí)檢測(cè)臂踝脈搏波速度(baPWV)和CIMT。<

6、br>　　采用SPSS13.0版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以(x)±s表示，計(jì)數(shù)資料以數(shù)量（率）表示。計(jì)量資料組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用x2檢驗(yàn)。兩個(gè)變量之間的關(guān)系用相關(guān)系數(shù)表示，多個(gè)變量之間關(guān)系用多元回歸分分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:MS患者ghrelin水平較正常對(duì)照組低(t=1.992，P=0.048)，而CIMT(t=5.336，P=0.000)及baPWV(t=2.698，P=0.

7、007)則較高;頸動(dòng)脈狹窄發(fā)生率MS人群明顯高于對(duì)照組(x2=5.696，P=0.017)。MS組中g(shù)hrelin與baPWV(r=0.412,P=0.001)、CIMT(r=0.213,P=0.035)、LDL(r=0.412,P=0.001)、總膽固醇(r=0.305，P=0.000)，年齡(r=-0.186，P=0.014)、BMI(r=-0.553，P=0.014)相關(guān)，多元回歸分析在調(diào)整了年齡、性別、血壓、血糖等因素后(R2=

8、0.318，P=0.023),ghrelin與baPWV(β=0.532,P=0.000,95％CI27.97～32.67)、LDL(β=-0.600,P=0.004,95％CI-216.66～-278.97)、BMI(β=-0.400, P=0.023,95％CI-29.82～-24.16)獨(dú)立相關(guān)，與CIMT無(wú)關(guān)。
　　結(jié)論:ghrelin水平在MS患者中較低。Ghrelin水平隨動(dòng)脈僵硬度增加及動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的加重而升高。

9、老年MS患者中g(shù)hrelin隨年齡增加而降低，隨BMI增加而下降，隨LDL升高ghrelin水平升高。
　　基礎(chǔ)研究部分:
　　方法:
　　第一步確定oxLDL對(duì)HUVEC細(xì)胞的作用:將細(xì)胞分為對(duì)照組，5mg/LoxLDL，10mg/L oxLDL，20mg/L oxLDL組，分別作用6小時(shí)，12小時(shí)，24小時(shí)，48小時(shí)。分別用MTT法和流式細(xì)胞儀法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。目的是獲得oxLDL導(dǎo)致HUVEC細(xì)胞損傷的濃度及時(shí)

10、間關(guān)系。
　　第二步:在第一步的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上將細(xì)胞分為對(duì)照組，10mg/L oxLDL干預(yù)組，10-6mol/L ghrelin干預(yù)組，10-8mol/Lghrelin組+10mg/L oxLDL，10-7mol/Lghrelin+10mg/L oxLDL組，10-6mol/L ghrelin+10mg/L oxLDL組，分別用ghrelin預(yù)處理10分鐘，30分鐘，60分鐘，120分鐘后再用oxLDL處理120分鐘，對(duì)照組用生理鹽

11、水干預(yù)，10mg/L oxLDL干預(yù)組在預(yù)處理階段用生理鹽水進(jìn)行處理，10-6mol/L ghrelin干預(yù)組在干預(yù)階段用生理鹽水處理。完成上述處理后，分別用MTT法和流式細(xì)胞儀法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。目的是獲得ghrelin對(duì)HUVEC細(xì)胞作用的濃度及時(shí)間關(guān)系。
　　第三步:在以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上（恰當(dāng)?shù)臐舛群妥饔脮r(shí)間）將細(xì)胞分為對(duì)照組，oxLDL組，ghrelin組，ghrelin+oxLDL組，ghrelin+D-Lys-3-G

12、HRP-6(ghrelin受體GHS-R1a阻滯劑，10-4mol/L在加用ghrelin前預(yù)處理1小時(shí))組，ghrelin+oxLDL+LY294002（PI3K阻滯劑，10-5mol/L預(yù)處理1小時(shí)）組，ghrelin+oxLDL+PD98059(ERK1/2阻滯劑，5×10-5mol/L預(yù)處理30分鐘)組。凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)及p-Akt、p-ERK1/2情況來(lái)進(jìn)一步研究ghrelin抗HUVEC細(xì)胞凋亡的機(jī)制。
　　第四步:

13、在第三步的基礎(chǔ)上加用ghrelin受體抑制劑D-Lys-3-GHRP-6、PI3K抑制劑LY294002和ERK1/2抑制劑PD98059。ghrelin受體GHS-R1a阻滯劑，10-4mol/L在加用ghrelin前預(yù)處理1小時(shí)，LY294002（PI3K阻滯劑）10-5mol/L預(yù)處理1小時(shí)，PD98059（ERK1/2阻滯劑）5×10-5mol/L預(yù)處理30分鐘，然后分別加入ghrelin及oxLDL。觀察細(xì)胞凋亡情況（MTT和

14、流式細(xì)胞儀法）。
　　結(jié)果:HUVEC細(xì)胞在不同濃度(5mg/L、10mg/L、20mg/L)和不同作用時(shí)間(10分鐘、30分鐘、60分鐘、120分鐘)的oxLDL干預(yù)后，細(xì)胞存活率均較對(duì)照組有不同程度下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。當(dāng)oxLDL濃度達(dá)到20mg/L時(shí)，其影響HUVEC細(xì)胞生存的作用達(dá)到本研究觀察到的最大效應(yīng)(P＜0.05)。HUVEC細(xì)胞的數(shù)量在oxLDL刺激10min后開(kāi)始明顯減少(P＜0.05)，于120min達(dá)到

15、本研究觀察的最高峰(P＜0.05)。
　　觀察ghrelin對(duì)HUVEC細(xì)胞活性的影響結(jié)果顯示，HUVEC細(xì)胞經(jīng)不同濃度(10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L)ghrelin預(yù)處理10min-120min后，再加10mg/L的oxLDL培養(yǎng)120分鐘，結(jié)果顯示隨ghrelin濃度增加和作用時(shí)間延長(zhǎng)，HUVEC細(xì)胞存活數(shù)量也相應(yīng)增加，在濃度達(dá)到10-6mol/L、作用時(shí)間達(dá)到30min時(shí)，較單純oxLDL處理組

16、差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，濃度為10-6mol/L作用時(shí)間為120分鐘時(shí)最為顯著(P＜0.05)，HUVEC數(shù)量與對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。提示，ghrelin對(duì)HUVECs具有明顯保護(hù)作用，能顯著抑制oxLDL對(duì)HUVECs的損傷。單純ghrelin處理組存活率較對(duì)照組沒(méi)有明顯差別，提示ghrelin在正常情況下對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有明顯影響。
　　不同濃度不同作用時(shí)間ghrelin處理組相比，發(fā)現(xiàn)ghrelin

17、的內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用呈時(shí)間和濃度依賴(lài)性。
　　為進(jìn)一步明確ghrelin對(duì)oxLDL導(dǎo)致的HUVECs細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用機(jī)制，我們用Western Blot法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，包括Bcl-2蛋白、Bax蛋白、Cleaved caspase-3表達(dá)，計(jì)算Bax/Bcl-2比值。
　　Bcl-2蛋白:與對(duì)照組HUVEC細(xì)胞相比，oxLDL(10mg/L)可使Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著降低(P＜0.05);單純ghr

18、elin處理組則沒(méi)有明顯影響;加入ghrelin后，即10-6mol/L ghrelin和10mg/L oxLDL共處理組使Bcl-2的表達(dá)較單純oxLDL組顯著上升(P＜0.05)。
　　Bax蛋白:與對(duì)照組HUVEC細(xì)胞相比，oxLDL可使Bax蛋白表達(dá)量顯著升高(P＜0.05);加入ghrelin后，即ghrelin和oxLDL共處理組使Bax的表達(dá)較mmol/L單純oxLDL組明顯下降(P＜0.05);與對(duì)照組比較，單純g

19、hrelin組Bax蛋白表達(dá)量無(wú)明顯變化(P＞0.05)。
　　Bax/Bcl-2比值:與對(duì)照組HUVEC細(xì)胞相比，oxLDL可使Bax/Bcl-2比值顯著升高(P＜0.05);加入ghrelin后，即和oxLDL共處理使Bax/Bcl-2比值較單純oxLDL組明顯下降(P＜0.05);與單純oxLDL處理組相比，單純ghrelin處理組Bax/Bcl-2比值無(wú)明顯變化(P＞0.05)。
　　Cleaved caspase-

20、3蛋白:與對(duì)照組HUVEC細(xì)胞相比，oxLDL可使Cleavedeaspase-3蛋白表達(dá)量顯著升高(P＜0.05);加入ghrelin后，即ghrelin和oxLDL共處理使Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量較單純oxLDL組明顯下降(P＜0.05);與單純oxLDL處理組相比，單純ghrelin處理組Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量無(wú)明顯變化(P＞0.05)。
　　上述結(jié)果提示，oxLDL可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡

21、蛋白Bax和Cleaved caspase-3的表達(dá)，減少抑制細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá);而ghrelin可以抑制oxLDL引起的Bax和Cleaved caspase-3表達(dá)增加，促進(jìn)Bcl-2表達(dá)，這可能是ghrelin對(duì)oxLDL引起的細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用的重要機(jī)制。
　　我們的研究表明，ghrelin可以激活A(yù)kt使之磷酸化為p-Akt，也可以激活ERK1/2磷酸化。所以推論ghrelin的生物學(xué)效應(yīng)可能是通過(guò)Akt和E

22、RK1/2激活磷酸化而產(chǎn)生。本研究顯示經(jīng)ERK1/2抑制劑(PD98059)預(yù)處理，可以抑制ghrelin引起的ERK1/2磷酸化，但不影響Akt激活;然而PI3K/Akt通路抑制劑(LY294002)可以同時(shí)減弱ghrelin引起的Akt和ERK1/2磷酸化。上述結(jié)果表明，ghrelin抗oxLDL導(dǎo)致的HUVEC細(xì)胞凋亡作用可能與激活PI3K/Akt和MAPK通路有關(guān)。Gherlin影響HUVEC細(xì)胞ERK1/2的作用達(dá)峰時(shí)間為30

23、分鐘，作用Akt的達(dá)峰時(shí)間為60分鐘。
　　本研究顯示分別經(jīng)10-4mol/L的ghrelin受體阻滯劑D-Lys-3-GHRP-6預(yù)處理1小時(shí)、5×10-5mol/L的ERK1/2抑制劑PD98059預(yù)處理30分鐘、10-5mol/L的PI3K/Akt通路抑制劑LY294002預(yù)處理1小時(shí)后發(fā)現(xiàn)，上述各組細(xì)胞經(jīng)MTT法和流式細(xì)胞儀法檢測(cè)存活情況與對(duì)照組比較沒(méi)有顯著差別P＞0.05，與oxLDL組比較存活率顯著增高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別P

24、＜0.05。提示:上述三種抑制劑對(duì)細(xì)胞存活沒(méi)有明顯影響。D-Lys-3-GHRP-6預(yù)處理后加用oxLDL和ghrelin處理的細(xì)胞其存活率較單純D-Lys-3-GHRP-6預(yù)處理組和對(duì)照組有所下降，但高于oxLDL組，提示:ghrelin受體可能參與了ghrelin抑制細(xì)胞凋亡的過(guò)程，同時(shí)也可能存在GHR外的細(xì)胞通路。PD98059預(yù)處理后加用oxLDL和ghrelin處理的細(xì)胞其存活率較單純PD98059預(yù)處理組和對(duì)照組有所下降，但

25、高于oxLDL組，提示:ERK1/2通路可能參與了ghrelin抑制細(xì)胞凋亡的過(guò)程，同時(shí)也可能存在GHR外的細(xì)胞通路。LY294002預(yù)處理后加用oxLDL和ghrelin處理的細(xì)胞其存活率較單純LY294002預(yù)處理組和對(duì)照組有所下降，高于oxLDL組，但MTT法結(jié)果沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別P=0.2088，提示:Akt通路可能參與了ghrelin抑制細(xì)胞凋亡的過(guò)程，由于該通路阻斷后較其他兩組阻滯劑效果更為明顯，因此推斷該通路可能是ghreli

26、n抑制細(xì)胞凋亡的主要作用通路。
　　結(jié)論:老年MS患者血清ghrelin濃度較低;在老年MS患者中，ghrelin濃度隨動(dòng)脈僵硬度增加及動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的加重而升高，其中與動(dòng)脈僵硬度的關(guān)系不受傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素的影響，與ghrelin獨(dú)立相關(guān);老年MS患者血清ghrelin水平隨年齡、BMI增加而下降，隨LDL水平升高而升高。本研究在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)oxLDL能夠造成內(nèi)皮細(xì)胞損傷和凋亡;ghrelin干預(yù)可以減輕oxLDL對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的