內(nèi)皮祖細(xì)胞移植對大鼠短暫性大腦中動(dòng)脈栓塞治療作用及機(jī)制的初步研究.pdf

1、背景：
　　 在缺血性腦血管病的治療研究中，神經(jīng)保護(hù)理論在基礎(chǔ)研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中都取得了較好的效果，但臨床試驗(yàn)無明顯療效。溶栓治療可有效恢復(fù)局部腦血流供應(yīng)、挽救缺血半暗帶組織，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，但由于時(shí)間窗過短(≤4.5h)限制了臨床廣泛應(yīng)用。因此，研究者的眼光從單純神經(jīng)或血管的保護(hù)擴(kuò)展到了神經(jīng)血管單元保護(hù)的策略。2003年，ABPN提出設(shè)立血管神經(jīng)病學(xué)專業(yè)的申請并得到了批準(zhǔn)[1]。此后，人們開始把保護(hù)神經(jīng)血管單元的研究作為解決腦

2、缺血治療困境的重要策略之一。
　　 在有關(guān)神經(jīng)血管單元保護(hù)策略的研究中，人們改變了以往過多關(guān)注神經(jīng)元或血管保護(hù)的理念，開始把神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞、微血管內(nèi)皮細(xì)胞及基質(zhì)之間的相互作用作為一個(gè)整體來看待。其中，EPCs作為研究這一策略的途徑之一，也已成為了大家關(guān)注的熱點(diǎn)。EPCs移植可以在修復(fù)血管內(nèi)皮損傷、促進(jìn)血管生成(angiogenesis)和血管發(fā)生(vasculogenesis)方面發(fā)揮保護(hù)作用，這一結(jié)果已得到了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證[

3、2、3]。同時(shí)，也有學(xué)者通過總結(jié)前人的實(shí)驗(yàn)研究推測[4]，EPCs移植還可能通過旁分泌細(xì)胞因子(VEGF、BDNF、HGF等)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，而且這一作用是獨(dú)立于血管生成和血管發(fā)生作用以外的。結(jié)合以上觀點(diǎn)，我們推測，EPCs移植有可能對神經(jīng)血管單元發(fā)揮保護(hù)作用，而這一保護(hù)作用的重要機(jī)制之一是通過EPCs旁分泌VEGF介導(dǎo)的。
　　 VEGF稱為血管內(nèi)皮生長因子，它通過與受體結(jié)合促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和新生血管形成。進(jìn)一步研究表明，在

4、神經(jīng)細(xì)胞的應(yīng)激狀態(tài)下(如缺氧、葡萄糖剝奪等)，VEGF有神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)營養(yǎng)作用[5]。這一作用可能是通過抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生和血管發(fā)生等途徑實(shí)現(xiàn)。已有的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，體外培養(yǎng)的EPCs有分泌VEGF的作用[6]。但是，EPCs在體研究，即通過EPCs移植能否對腦缺血損傷發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用？其作用機(jī)制是什么？目前對這些問題的研究尚未取得一致意見。
　　 為此，我們的實(shí)驗(yàn)從EPCs可以在體外分泌VEGF的研究基礎(chǔ)入手，通過構(gòu)建大

5、鼠tMCAO模型，經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈移植EPCs，采用免疫組織化學(xué)方法觀察EPCs移植后是否能在缺血局部腦組織定位并旁分泌VEGF，并采用免疫組織化學(xué)、分子生物學(xué)等技術(shù)，觀察不同時(shí)相皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡及VEGF、caspase-3表達(dá)水平變化，探討三者之間變化的關(guān)系，旨在初步闡明EPCs移植對大鼠tMCAO模型的治療作用及其機(jī)制，為臨床缺血性腦血管疾病的治療提供新的方法及理論依據(jù)。
　　 目的：
　　 觀察EPCs經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈移植對t

6、MCAO大鼠腦缺血損傷的保護(hù)作用，并初步探討其機(jī)制。
　　 方法：
　　 (1)分離、培養(yǎng)、鑒定大鼠骨髓來源EPCs；(2)建立大鼠tMCAO模型；(3)經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈移植EPCs到tMCAO大鼠，設(shè)立PBS經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈注射作為對照；(4)觀察如下指標(biāo)：①采用干細(xì)胞染色示蹤技術(shù)，觀察EPCs能否定位于缺血局部腦組織；②采用普通HE染色觀察大鼠缺血部位病理變化；③分別于移植后的第1、3、5、7天采用TUNEL法觀察皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡

7、變化、免疫組化法檢測VEGF、Caspase-3表達(dá)變化、Western Blot檢測缺血局部腦組織VEGF表達(dá)量的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1、分離的大鼠骨髓來源單核細(xì)胞，經(jīng)過VEGF、bFGF的誘導(dǎo)分化，培養(yǎng)的細(xì)胞表現(xiàn)出典型的“血島樣”集落、“鋪路石”樣細(xì)胞形態(tài)，具有吞噬DiI-ac-LDL功能，CD34和vWF細(xì)胞免疫熒光染色陽性。提示分離培養(yǎng)的細(xì)胞為EPCs。
　　 2、EPCs吞噬DiI-ac-LDL

8、染色后胞漿呈紅色熒光，經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈移植到大鼠tMCAO模型，3天后冰凍切片觀察缺血局部腦組織，可以在毛細(xì)血管壁見到大量紅色熒光細(xì)胞，在正常腦組織少見紅色熒光細(xì)胞。PBS對照組缺血局部腦組織毛細(xì)血管壁未見紅色熒光細(xì)胞。提示經(jīng)內(nèi)頸動(dòng)脈注射，EPCs可以定位于缺血腦組織。
　　 3、頸內(nèi)動(dòng)脈移植EPCs對tMCAO大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡的影響：通過TUNEL法，觀察缺血部位神經(jīng)元凋亡，發(fā)現(xiàn)PBS頸內(nèi)動(dòng)脈注射對照組陽性細(xì)胞第1、3、5天分別為

9、(105.72±2.69)、(132.96±2.88)、(145.12±3.22)，隨時(shí)間延長逐漸升高且與前一時(shí)相點(diǎn)相比有顯著差異(P<0.05)；而EPCs移植組陽性細(xì)胞數(shù)分別為(91.84±3.21)、(82.08±2.77)、(54.68±3.12)，隨時(shí)間延長逐漸降低且與前一時(shí)相點(diǎn)相比有顯著差異(P<0.05)。與對應(yīng)時(shí)相比較，經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈注射EPCs后大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡數(shù)量均明顯少于PBS對照組(P<0.05)。提示經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈移

10、植EPCs可以明顯減少tMCAO大鼠腦組織神經(jīng)元凋亡。
　　 4、頸內(nèi)動(dòng)脈移植EPCs對tMCAO大鼠皮質(zhì)Caspase-3表達(dá)的影響：通過免疫組化法，觀察缺血部位神經(jīng)元Caspase-3表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)的變化，發(fā)現(xiàn)PBS對照組陽性細(xì)胞數(shù)第1、3、5天分別為(81.48±3.80)、(103.00±2.73)、(122.92±2.65)，隨時(shí)間延長逐漸增加且與前一時(shí)相點(diǎn)相比有顯著差異(P<0.05)；經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈EPCs移植組Cas

11、pase-3陽性細(xì)胞數(shù)分別為(71.88±2.55)、(60.84±3.06)、(31.24±2.73)，隨時(shí)間延長逐漸減少且與前一時(shí)相點(diǎn)相比有顯著差異(P<0.05)。與對應(yīng)時(shí)相PBS對照組比較，經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈注射EPCs后大鼠皮質(zhì)Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)均顯著減少(P<0.05)。提示經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈移植EPCs可以明顯抑制tMCAO大鼠Caspase-3表達(dá)。
　　 5、頸內(nèi)動(dòng)脈移植EPCs對tMCAO大鼠缺血局部腦組織VEGF

12、表達(dá)的影響：通過免疫組化法，從形態(tài)學(xué)上發(fā)現(xiàn)EPCs移植組有較多VEGF陽性細(xì)胞，而PBS對照組對應(yīng)區(qū)域少見VEGF陽性細(xì)胞。進(jìn)一步應(yīng)用Western Blot觀察缺血局部腦組織VEGF蛋白表達(dá)量變化發(fā)現(xiàn)：PBS對照組VEGF表達(dá)量第1、3、5天分別為(0.21±0.02)、(0.34±0.03)、(0.29±0，05)，隨時(shí)間延長呈不穩(wěn)定的低水平表達(dá)；而EPCs移植組VEGF蛋白表達(dá)量分別為(0.47±0.02)、(0.56±0.01)

13、、(0.99±0.03)，隨時(shí)間延長逐漸增加且與前一時(shí)相點(diǎn)相比有顯著差異(P<0.05)。與對應(yīng)時(shí)相PBS對照組比較，經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈注射EPCs后大鼠缺血局部腦組織VEGF表達(dá)量均顯著增加(P<0.05)。提示經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈移植EPCs可以明顯上調(diào)tMCAO大鼠缺血局部腦組織VEGF表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 1、分離的大鼠骨髓來源單核細(xì)胞，經(jīng)過VEGF、bFGF的誘導(dǎo)分化，鑒定符合EPCs特征。
　　 2、EPCs經(jīng)頸

14、內(nèi)動(dòng)脈移植tMCAO大鼠后，較多定位于缺血局部腦組織毛細(xì)血管壁，較少定位于正常側(cè)腦組織毛細(xì)血管壁。
　　 3、EPCs移植組與PBS組相比較，隨著移植后時(shí)間的延長，皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡數(shù)量逐漸減少，同時(shí)缺血局部腦組織VEGF蛋白表達(dá)逐漸升高，伴有缺血腦組織Caspase-3蛋白表達(dá)逐漸降低。研究結(jié)果提示經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈移植EPCs對tMCAO大鼠腦組織的神經(jīng)保護(hù)作用可能與其通過旁分泌VEGF抑制了Caspase-3表達(dá)，從而減少了皮質(zhì)神經(jīng)元