胸腺素β4對(duì)循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞的作用及機(jī)制.pdf

1、血管內(nèi)皮損傷在心血管疾病中的重要性已被廣泛認(rèn)同。成熟內(nèi)皮細(xì)胞能夠修復(fù)損傷內(nèi)皮，但是其再生能力有限。因此越來越多的科學(xué)研究者關(guān)注內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)在血管修復(fù)、重構(gòu)和血管新生中的作用。盡管目前對(duì)于EPCs的確切來源和功能定義仍存有爭(zhēng)議，但大量新興研究表明，EPCs在缺血組織的血管新生、內(nèi)皮損傷的修復(fù)等方面扮演重要角色，然而，多種心血管疾病或心血管疾病危險(xiǎn)因素諸如老齡、高血壓、高膽

2、固醇血癥、吸煙、糖尿病等會(huì)使循環(huán)EPCs的功能受損，從而限制了基于EPCs的細(xì)胞治療手段在臨床中的應(yīng)用。既然異體輸注健康人捐獻(xiàn)的EPCs要面臨免疫排斥問題，因此我們有理由相信功能修飾(如促進(jìn)EPCs動(dòng)員、歸巢、存活或分泌保護(hù)性生長(zhǎng)因子等)自體EPCs可能是將來EPCs-細(xì)胞治療心血管疾病的重要策略。胸腺素β4(thymosinβ4，Tβ4)，一種由43個(gè)氨基酸殘基組成的小分子量蛋白，廣泛分布于人體內(nèi)多種組織與細(xì)胞中。Tβ4介導(dǎo)了多種生物

3、學(xué)反應(yīng)，如血管新生、創(chuàng)傷愈合等。此前研究表明，Tβ4能增強(qiáng)多種干/祖細(xì)胞的增殖、遷移、分化等功能，進(jìn)而促進(jìn)血管新生及心肌修復(fù)。但是，目前國(guó)內(nèi)外尚缺乏Tβ4對(duì)循環(huán)EPCs的作用及機(jī)制的系統(tǒng)研究。我們近期研究發(fā)現(xiàn)Tβ4能夠通過激活PI3K/Akt/eNOS信號(hào)通路促進(jìn)EPCs遷移，但是Tβ4對(duì)于EPCs凋亡、增殖、衰老等功能的影響仍有待進(jìn)一步研究。基于上述考慮，我們提出假設(shè)：Tβ4能增強(qiáng)循環(huán)EPCs的功能，促進(jìn)血管內(nèi)皮損傷的修復(fù)，維持血管內(nèi)

4、皮的完整性，從而增強(qiáng)循環(huán)EPCs的心血管保護(hù)作用。由于目前國(guó)內(nèi)外對(duì)Tβ4影響EPCs的功能及其機(jī)制方面的研究甚少，我們首先觀察了Tβ4對(duì)EPCs活性、增殖、粘附、集落形成和衰老等功能的影響；其次我們研究了Tβ4對(duì)EPCs凋亡的作用，并探討了可能參與其中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制；最后我們還觀察了Tβ4對(duì)EPCs旁分泌作用的影響。以下分三部分對(duì)本研究的方法、結(jié)果及結(jié)論作一簡(jiǎn)述。
　　 第一部分：胸腺素β4對(duì)循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的影響。
　

5、　 目的：觀察外源性Tβ4體外干預(yù)對(duì)循環(huán)EPCs功能的影響。
　　 方法：采用密度梯度離心法從健康人外周血獲取單個(gè)核細(xì)胞，接種于人纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)板，培養(yǎng)7d后，采用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)FITC-UEA-I及DiI-acLDL雙染色鑒定EPCs，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其表面標(biāo)志(VEGFR-2，CD34，CD133)，進(jìn)一步鑒定EPCs。加入不同濃度Tβ4(1、10、100和1000ng/mL)干預(yù)不同時(shí)間后。分別采用MTT

6、比色法、Brdu細(xì)胞增殖試劑盒、粘附能力測(cè)定、集落形成實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)和SA-β-半乳糖苷酶染色試劑盒觀察EPCs的活性、增殖、粘附、集落形成和衰老。
　　 結(jié)果：Tβ4呈濃度依賴地增加EPCs的活性、增殖、集落形成和粘附能力，在1000ng/mL組達(dá)到最大效應(yīng)(與對(duì)照組比較，細(xì)胞活性0.410±0.052vs0.264±0.035，P<0.05；增殖能力0.802±0.081 vs0.593±0.042，P<0.05；粘附能力44.4

7、±3.4 vs17.8±4.3，P<0.05；集落形成能力17.3±3.1 vs5.7±2.1，P<0.05)。此外，Tβ4干預(yù)還顯著抑制EPCs的衰老，且呈一定的量效關(guān)系，在1000ng/mL時(shí)達(dá)到最大效應(yīng)(與對(duì)照組比較，20.67±3.06％vs45.33±3.51％，P<0.05)。
　　 結(jié)論：Tβ4可增強(qiáng)EPCs的細(xì)胞活性、增殖和粘附等功能，同時(shí)抑制EPCs的衰老，且Tβ4對(duì)EPCs功能的作用具有一定的濃度依賴性。

8、r>　　 第二部分：胸腺素β4對(duì)循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制。
　　 目的：觀察Tβ4對(duì)循環(huán)EPCs凋亡的作用并探討其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　 方法：從健康人外周血分離、培養(yǎng)循環(huán)EPCs。細(xì)胞培養(yǎng)至7d后，采用去血清培養(yǎng)48h以誘導(dǎo)EPCs凋亡。加入不同濃度的Tβ4處理后，western blot檢測(cè)EPCsAkt/p-Akt Ser473、eNOS/p-eNOS Ser1177、PTEN/PTEN Ser380、JNK

9、/p-JNK、P38/p-P38和ERK1/2/p-ERK1/2等信號(hào)通路蛋白以及凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、caspase-9、Bax、Bcl-2和細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。隨后，在分別加入磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3-kinase，PI3K)抑制劑、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)抑制劑、c-jun氨基末端激酶(c-junN-

10、terminal kinase，JNK)抑制劑等各種信號(hào)通路抑制劑預(yù)處理EPCs30min后，再予以1000ng/mL Tβ4干預(yù)24h，采用Annexin-V/PI凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)EPCs的凋亡率。
　　 結(jié)果：Tβ4干預(yù)顯著抑制去血清誘導(dǎo)的EPCs凋亡和胞漿細(xì)胞色素C水平，且呈濃度依賴性。PI3K抑制(LY294002和Wortmannin)或JNK抑制劑SP600125能夠拮抗Tβ4的抗凋亡作用。此外，Tβ4還抑制了ca

11、spase-3、caspase-9的表達(dá)和活性，同時(shí)上調(diào)Bcl-2/Bax比值。Tβ4能夠在EPCs能與ILK形成免疫復(fù)合物，增加ILK的活性而不影響其表達(dá)。ILK-siRNA轉(zhuǎn)染后完全抑制Tβ4對(duì)ILK-Akt的激活，從而最終拮抗了Tβ4對(duì)EPCs凋亡的作用。
　　 結(jié)論：Tβ4抑制去血清誘導(dǎo)的EPCs凋亡與ILK-Akt的激活有關(guān)，此外，JNK MAPK也可能參與了Tβ4對(duì)EPCs凋亡作用的調(diào)節(jié)。
　　 第三部分：胸

12、腺素β4對(duì)循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞旁分泌作用的影響。
　　 目的：觀察Tβ4對(duì)循環(huán)EPCs旁分泌作用的影響。
　　 方法：從健康人外周血分離、培養(yǎng)循環(huán)EPCs。EPCs條件培養(yǎng)液(EPCs-derivedconditioned medium，EPCs-CM)是循環(huán)EPCs用不含血清的EBM-2培養(yǎng)24h獲得。采用Ki-67免疫熒光檢測(cè)、Trans-well細(xì)胞遷移檢測(cè)和Martigel膠毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)形成分別檢測(cè)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(H

13、uman umbilical vein endothelial cells，HUVECs)體外增殖、遷移和血管形成能力。熒光定量PCR檢測(cè)EPCs內(nèi)VEGF、SDF-1、IGF-1、HGF-1、FGF-2、Tβ4和IL-8的表達(dá)。
　　 結(jié)果：EPCs-CM能夠顯著增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)形成能力。Tβ4干預(yù)能夠進(jìn)一步增強(qiáng)EPCs-CM對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響。此外，Tβ4干預(yù)增加EPCs內(nèi)VEGF、FGF-2、IL-