內(nèi)皮祖細胞移植對IgA腎病大鼠模型治療作用的研究.pdf

1、目的:
　　IgA腎病(Primary Immunoglobin A nephreopthy，IgAN)是指腎小球系膜區(qū)以IgA或IgA沉積為主，可伴系膜細胞增生和系膜基質(zhì)擴張的腎小球疾病。IgAN是腎小球性血尿最常見的原因，是世界范圍內(nèi)一種常見的腎小球疾病。在不同地區(qū)IgAN的發(fā)病率不同，以亞洲及澳洲發(fā)病率為高。大約25％的患者在確診IgAN后5年～25年內(nèi)發(fā)展為終末期腎臟疾病(end stage renal disease，E

2、SRD)。迄今為止IgAN的發(fā)病機制尚不明了，亦無特效的藥物治療方法，因此深入探討IgAN的發(fā)生機制，尋找新的治療措施，控制和延緩疾病的進展，是當前研究的重點。
　　IgAN是一種多致病因素引起的疾病，近年來有學者認為IgAN發(fā)病機制與骨髓干細胞(Bone Marrow Stem Cell，BMC)有關(guān)，并提出IgAN可能是一種干細胞疾病的觀點。國外有研究應(yīng)用骨髓干細胞移植治療IgAN大鼠，發(fā)現(xiàn)移植后腎小球系膜區(qū)IgA的沉積明顯減

3、少。內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cell，EPC)是骨髓干細胞的成分之一，是成年個體中與血管新生關(guān)系最為緊密的干細胞成分。近年的研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮祖細胞參與血管損傷修復及出生后的治療性血管新生，在動脈粥樣硬化，腦梗塞，下肢缺血等缺血性疾病的治療上成為研究熱點。本研究建立IgAN大鼠模型，觀察IgAN大鼠骨髓內(nèi)皮祖細胞的變化，并行內(nèi)皮祖細胞移植治療，旨在研究內(nèi)皮祖細胞移植對IgAN治療作用并探討治療機制。
　

4、　本研究分以下三部分進行:1.IgA腎病動物模型骨髓內(nèi)皮祖細胞數(shù)量及功能變化。2.內(nèi)皮祖細胞移植對IgA腎病大鼠的治療作用。3.內(nèi)皮祖細胞移植治療IgA腎病的可能機制。
　　材料和方法:
　　第一部分:1.動物分組及模型鑒定:雌性SD大鼠16只，隨機分為正常對照組和IgAN組，每組8只。①IgAN組:清潔級雌性SD大鼠，隔天灌服牛血清白蛋白(BSA)400mg/kg，持續(xù)6周;于第6.8周分別予脂多糖(LPS)0.25mg/

5、kg，尾靜脈注射。皮下注射蓖麻油0.5ml+四氯化碳(CCL4)0.1ml，每周一次，持續(xù)9周。②正常對照組:分別給予等量生理鹽水行灌胃，尾靜脈注射及皮下注射。兩組大鼠均正常飲食，飲水。在造模結(jié)束后，留取尿標本。處死大鼠留取血標本、腎組織標本、檢測24h尿蛋白定量、血尿素氮、血肌酐、血IgA水平，HE染色觀察腎組織病理改變，免疫熒光法觀察腎組織IgA的沉積。2.EPC的分離，鑒定及培養(yǎng):于超凈臺中取出大鼠股骨和脛骨，密度梯度法獲得骨髓單

6、核細胞懸液，接種于添加細胞因子的M199培養(yǎng)基中誘導培養(yǎng)。通過倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)，流式細胞儀檢測EPC表面抗原CD34、CD133、FLK-1的表達以及共聚焦顯微鏡觀察FITC-UEA-1和DIL-ac-LDL雙染色來進行鑒定。3.EPC功能比較:CCK8檢測內(nèi)皮祖細胞的增殖能力，Transwell小室檢測內(nèi)皮祖細胞的遷移能力。比較組間差異。
　　第二部分:1.模型制備方法及鑒定:SD大鼠，隔天灌服牛血清白蛋白(BSA)400

7、mg/kg，持續(xù)6周;于第6.8周分別予脂多糖(LPS)0.25mg/kg，尾靜脈注射。皮下注射蓖麻油0.5ml+四氯化碳(CCL4)0.1ml，每周一次，持續(xù)9周。檢測24h尿蛋白定量、血尿素氮、血肌酐、血IgA水平，HE染色觀察腎組織病理改變，免疫熒光法觀察腎組織IgA的沉積。2.EPC的分離及培養(yǎng):于超凈臺中取出大鼠股骨和脛骨，密度梯度法獲得骨髓單核細胞懸液，接種于添加細胞因子的M199培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)。3.動物分組及處理:雌性SD

8、大鼠48只，在IgAN造模結(jié)束后隨機分2組。①IgA腎病大鼠EPC移植組（簡稱EPC組，n=30）:經(jīng)尾靜脈給予同種雌性SD大鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細胞（骨髓內(nèi)皮祖細胞數(shù)量3×106/只，0.5ml/只）。②IgA腎病大鼠未移植組（簡稱IgAN組，n=6）:經(jīng)尾靜脈給予等量生理鹽水（0.5ml/只）。另設(shè)正常對照組(n=12):其中6只經(jīng)尾靜脈給予等量生理鹽水(0.5ml/只);另外6只經(jīng)尾靜脈給予同種雌性SD大鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細胞（骨髓內(nèi)皮

9、祖細胞數(shù)量3×106/只，0.5ml/只）僅用于觀察EPC的歸巢。EPC組在移植前和移植后的1、3、7、14天分別處死6只大鼠，IgAN組和正常對照組在移植后的14天處死大鼠。大鼠處死前用代謝籠留取24h尿標本。處死時留取血標本、腎組織標本。檢測24h尿蛋白定量、血尿素氮、血肌酐。HE和PAS染色觀察腎組織病理改變，應(yīng)用PAS染色切片計算腎小球系膜基質(zhì)增生程度，免疫組化法檢測腎組織CD31的表達，利用CD31染色的陽性物質(zhì)積分光密度值代

10、表腎小管周圍毛細血管網(wǎng)密度。免疫熒光法觀察內(nèi)皮祖細胞在腎臟的歸巢（移植前用紅色熒光染料PKH26標記內(nèi)皮祖細胞），
　　第三部分:1.模型制備方法及鑒定:隔天灌服牛血清白蛋白(BSA)400mg/kg，持續(xù)6周;于第6.8周分別予脂多糖(LPS)0.25mg/kg，尾靜脈注射。皮下注射蓖麻油0.5ml+四氯化碳(CCL4)0.1ml，每周一次，持續(xù)9周。檢測24h尿蛋白定量、血尿素氮、血肌酐、血IgA水平，HE染色觀察腎組織病理改

11、變，免疫熒光法觀察腎組織IgA的沉積。2.EPC的分離及培養(yǎng):于超凈臺中取出大鼠股骨和脛骨，密度梯度法獲得骨髓單核細胞懸液，接種于添加細胞因子的培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)。3.動物分組及處理:雌性SD大鼠42只，在IgAN造模后結(jié)束隨機分2組。①IgA腎病大鼠EPC移植組(簡稱EPC組，n=30)，經(jīng)尾靜脈給予同種雌性SD大鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細胞（骨髓內(nèi)皮祖細胞數(shù)量3×106/只，0.5ml/只）。②IgA腎病大鼠未移植組（簡稱IgAN組，n=6），

12、經(jīng)尾靜脈給予等量生理鹽水（0.5ml/只）。另設(shè)正常對照組(n=6)，經(jīng)尾靜脈給予等量生理鹽水（0.5ml/只）。EPC組在移植前和移植后的1、3、7、14天分別處死6只大鼠，IgAN組和正常對照組在移植后的14天處死大鼠。大鼠處死時留取腎組織標本。應(yīng)用免疫組織化學，Western-blotting及實時定量PCR的方法比較各組之間以及EPC組移植前后腎組織HIF-1a，MCP-1，CD105的表達變化。
　　數(shù)據(jù)處理:用計算機統(tǒng)

13、計軟件SPSS17.0進行分析處理。計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（(x)±s）表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，組間差異比較采用單因素方差分析，當P＜0.05時，差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果:
　　第一部分:1.生化指標比較: IgAN組24小時尿蛋白排泄量明顯增加，是正常對照組的7.1倍，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學意義，(P＜0.01)。IgAN組BUN，Scr增高，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學意義，(P＜0.01)。正常對照組

14、血清IgA（26.04±1.12）μg/ml，IgAN組血清IgA水平增高，為(28.99±1.30)μg/ml，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義，(P＜0.01)。2.流式細胞儀檢測結(jié)果:IgAN組骨髓CD133+FLK+，CD34+表達細胞較正常對照組明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義，(P＜0.01)。3.細胞計數(shù):激光共聚焦顯微鏡下，對正在分化的EPC計數(shù)，IgAN組骨髓內(nèi)皮祖細胞數(shù)較正常對照組減少33.3％，差異有統(tǒng)計學意義，(P＜0.0

15、5)。4.EPC增殖能力:48h后兩組細胞增殖出現(xiàn)顯著差異，分別在48h，72h比較兩組的A450吸光值，IgAN組骨髓EPC增殖能力顯著下降，差異均有統(tǒng)計學意義，(P＜0.01)。5.EPC的遷移能力:IgAN組骨髓EPC的遷移能力較正常組下降約10％，差異有統(tǒng)計學意義，(P＜0.05)。
　　第二部分:1.生化指標比較:與IgAN組比較，EPC組尿蛋白排泄量明顯減少，BUN、Scr明顯下降，差異均有統(tǒng)計學意義，(P＜0.05)

16、。EPC組在移植后7天，14天尿蛋白排泄量、BUN、Scr，與移植前比較明顯減少。差異均有統(tǒng)計學意義，(P＜0.05)。2.腎臟形態(tài)學:HE染色，IgAN組腎組織可見腎小球系膜細胞增多，系膜基質(zhì)增寬，部分腎小管上皮細胞濁腫變性，小管形態(tài)不規(guī)整。EPC組系膜基質(zhì)及腎小管病理改變較IgAN組減輕。PAS染色，腎小球ECM沉積EPC組（5.59±1.94％）較IgAN組（11.06±1.4％）明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義，(P＜0.01)。3.

17、免疫組織化學結(jié)果:IgAN組腎組織CD31陽性表達較正常對照組減少，(P＜0.01)。EPC組腎組織CD31陽性表達逐漸增加，PTC密度增加，與IgAN組比較差異有統(tǒng)計學意義，(P＜0.01)。4.EPC的歸巢:PKH26陽性表達呈紅色熒光，在移植后1天即可見PKH26陽性細胞出現(xiàn)在IgAN大鼠的腎臟，主要分布于腎間質(zhì)。在移植后的3，7，14天可見腎間質(zhì)和腎小球PKH26陽性細胞逐漸增多。
　　第三部分:1.免疫組織化學結(jié)果:①E

18、PC組腎組織MCP-1、HIF-1a的表達較IgAN組明顯減少，存在顯著差異。EPC組在移植后1，3，7，14天大鼠腎組織MCP-1、HIF-1a的表達較移植前逐漸減少。②正常組大鼠，CD105在腎小球和腎間質(zhì)微弱表達。在移植前和IgAN組大鼠腎間質(zhì)表達明顯增多。EPC組在移植后第3天CD105表達明顯減少，7、14天表達逐漸增多。2.免疫印跡結(jié)果:①EPC組大鼠腎組織MCP-1、HIF-1a的表達逐漸減少，較IgAN組明顯減少。差異有

19、統(tǒng)計學意義。②IgAN組CD105表達水平較正常組增高，EPC組在移植后1天CD105水平有所下降，3天腎組織CD105蛋白表達明顯減少，7天，14天CD105蛋白表達逐漸增加。
　　3.實時熒光定量PCR結(jié)果:①EPC組在移植后1，3，7，14天腎組織MCP-1表達逐漸減少。分別較移植前減少32.38％，45.71％，53.8％，68.1％，差異有統(tǒng)計學意義。②正常組大鼠腎皮質(zhì)CD105mRNA少量表達，IgAN組CD105mR

20、NA表達增多，EPC組在移植后第三天CD105mRNA顯著減少，7，14天逐漸增多。③正常組大鼠腎組織HIF-1amRNA少量表達，IgAN組HIF-1amRNA表達明顯增加，達正常組的2.43倍，移植后HIF-1a mRNA表達逐漸減少。
　　結(jié)論:
　　本研究結(jié)果表明:
　　1.IgAN動物模型骨髓EPC數(shù)量減少，EPC增殖能力減低，遷移能力下降（與正常對照組比較）。說明IgAN大鼠骨髓EPC數(shù)量和功能受損，可能影

21、響內(nèi)皮細胞的損傷修復和有效的更新。
　　2.EPC移植治療，可以使IgAN大鼠尿蛋白的排泄減少，腎功能得到改善。
　　3.EPC移植治療，IgAN大鼠腎組織腎小球ECM沉積減少，腎小管周圍毛細血管密度增加。可能進而延緩腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化的進展，為IgAN的治療開拓了新途徑。
　　4.EPC移植治療，IgAN大鼠腎組織MCP-1，HIF-1a的表達逐漸減少，CD105的表達在移植3天后逐漸上調(diào)。推測EPC移植治療I