NRG1-ErbB4通過GABA能系統抑制杏仁外側核的LTP.pdf

1、精神分裂癥是一種嚴重危害人類健康的精神疾病,它影響著全世界約1％的人口。Neuregulin1(NRG1)與ErbB4作為精神分裂癥眾多易感基因中的一員,在近年來正在被越來越多的人重視并已成為神經科學研究的熱點之一。
　　 Neuregulin是一類隸屬于營養(yǎng)因子家族的多肽因子,其由NRG基因編碼產物的選擇性剪切體所組成。在NRG的多種異構體當中(NRG 1-4),對NRG1的研究最為廣泛。NRG1通過ErbB受體酪氨酸激酶起作

2、用,ErbB受體同樣具有多種異構體(ErbB1-4)。其中ErbB4在腦內高表達,并與NRG1結合后可激活其酪氨酸激酶的活性。NRG1-ErbB4信號通路在神經系統的發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用,并且以往的研究大都集中于此。現已發(fā)現它參與了神經細胞的分化、神經元的遷移、神經突起的外向性生長和突觸的形成等多個神經發(fā)育過程。盡管NRG1和ErbB4受體在成年的嚙齒類動物和人的大腦中也高度表達,但目前對于NRG1-ErbB4信號通路在神經系統功能的

3、認識絕大部分儀限于早期發(fā)育階段,對于此信號通路在成年腦區(qū)中的作用以及對于其在精神分裂癥中的病理機制仍然不甚明了。
　　 精神分裂癥病人表現有情感異常,MRI的研究證明這些情感異常與杏仁核十分相關。近年的研究顯示NRG1突變小鼠表現出情景恐懼記憶以及社交障礙。眾所周知,恐懼記憶是反映大腦形成不良情感記憶的一種常用的模型。已有研究證明杏仁核在恐懼記憶模型中扮演著事十分關鍵的角色,而杏仁核的長時程增強(LTP)被認為是形成恐懼記憶的一

4、個重要機制。與其它腦區(qū)不同,杏仁核神經元動作電位的靜息發(fā)放水平很低,這主要是由于該腦區(qū)具有很強的GABA能抑制活性,并且,GABA能抑制對杏仁核LTP也具有很強的控制作用。而目前對杏仁核這種強GABA能抑制的機制尚不清楚。在海馬,NRG1可通過激活ErbB4抑制LTP的誘導,有研究表明ErbB4受體存在于GABA(γ-aminobutyricacid)能神經元的突觸前末梢,NRG1可通過激活突觸前的ErbB4受體增強活動依賴的GABA釋

5、放。因此有必要研究:杏仁核中NRG1-ErbB4信號通路是否通過調節(jié)GABA能系統來控制LTP的誘導水平。
　　 首先,我們記錄了EPSC與IPSC的輸入-輸出關系(I-o),并使用IPSC/EPSC比證明了杏仁核相較于其它腦區(qū)具有更高GABA能水平。我們同時比較了外側杏仁核,海馬(CA1)與皮層(頂葉皮層,第五層細胞)所記錄的IPSC的最大值。與海馬(506.41±65.45 pA,n=10)及皮層(682.44±79.98

6、pA,n=9)相比,在外側杏仁核的興奮性神經元可以記錄到更大幅度的IPSC(871.40±57.07pA,n=10),其中儀外側杏仁核與海馬兩組間有顯著性差異(P<0.05,one wayANOVA)。隨后觀察了上述三個腦區(qū)的輸入-輸出關系,我們發(fā)現只有外側杏仁核的IPSC I-O曲線保持在EPSC I-O曲線的上方,而海馬和皮層IPSC I-O曲線均落在了EPSC I-O曲線的下方。而且,從IPSC/EPSC比可以看出外側杏仁核與海馬

7、(其在20,25,30,35,40V刺激強度下,P<0.05,獨立樣本T檢驗)和皮層(在10,15V的刺激強度下,P<0.05,獨立樣本T檢驗)均有顯著的差異。與以上結果相符,在外側杏仁核中無法誘導出LTP。當給予丘腦傳入纖維一個強直刺激(HFS)后,所記錄到的fEPSP強度相對于刺激前的基線只有102.3±2.5％(n=8)。與此相反,HFS刺激則可在海馬CA1區(qū)誘導出LTP(158.5±11.2％,n=14)。使用獨立樣本的T檢驗也

8、顯示出兩個區(qū)域所誘導的LTP水平有顯著性的差異(P=0.000)。這一結果提示外側杏仁核中較高的GABA能水平阻止了LTP的產生。為了進一步肯定GABA能系統對LTP的抑制作用,在灌流液中加入20μM荷包牡丹堿(Bicuculline methiodidie,BMI,GABAA受體阻斷劑)以觀察誘導LTP的情況。我們發(fā)現在20μM荷包牡丹堿存在情況下,在外側杏仁核可誘導出顯著的LTP,其幅度為119.2±1.6％(n=6),而對照腦片中

9、其幅度只有102.34±2.5％(n=8),且兩組間有顯著性差異(P<0.05)。這一結果表明GABA能系統抑制了外側杏仁核中LTP的產生。
　　 為了探討NRG1-ErbB4是否可以調節(jié)GABA能抑制系統,我們在灌流1mM犬尿喹啉酸(廣譜的谷氨酸受體抑制劑)的條件下,使用雙極電極刺激丘腦傳入,記錄了外側杏仁核興奮性神經元中誘發(fā)的抑制性突觸后電流(eIPSC)。灌流NRG1(2nM,n=9)對IPSC的幅度無顯著影響。NRG1灌

10、流10分鐘后標準化的IPSC幅度為0.90±0.05(P>0.05)。與此相反,灌流ecto-ErbB4(克隆蛋白,包含ErbB4的胞外段,可中和NRG1蛋白而起到抑制NRG1-ErbB4信號活性的作用)或AG1478(一種脂溶性的ErbB受體抑制劑,其可以阻止受體的自磷酸化并阻斷其信號傳遞)均可顯著抑制IPSC的幅度,ecto.ErbB4或AG1478處理后標準化IPSC幅度分別為0.65±0.05(2μg/ml,n=8,P<0.01

11、)和O.70±0.04(5μM,n=10,P<0.01)。以上結果表明NRG1對eIPSC無明顯影響,而NRG1-ErbB4通路的阻斷劑則可以抑制eIPSC,提示生理條件下外側杏仁核NRG1-ErbB4通路對GABA能系統的調控作用處于飽和狀態(tài)。
　　 為了探討NRG1-ErbB4是否可以調節(jié)外側杏仁核中的LTP,我們進行了以下三組實驗?？瞻讓φ战M:強直刺激后fEPSP的幅度為刺激前基線的99.874±3.15％(n=8)；NR

12、G1處理組:105.49±2.47％(n=6)；ecto-ErbB4(2μg/ml,n=7)處理組:117.97±3.72％。統計處理顯示ecto-ErbB4處理組與其他兩組之間都有顯著性的差異(F=8.092,P=O.003,P<0.05與對照相比)。這一結果表明NRG1-ErbB4信號通路在外側杏仁核區(qū)控制著LTP的誘導,并且處于一種相對飽和的狀態(tài)而只能被負調控。
　　 同樣,2μg/ml ecto-ErbB4預處理后,在皮

13、層傳入施加強直刺激可誘導出LTP(123.05±4.82％,n=8),與對照腦片(107.59±2.90％,n=6)相比有顯著性的差異(P<0.05)。這一結果顯示與丘腦傳入相同,抑制NRG1-ErbB4信號通路可在外側杏仁核的皮層傳入也誘導出LTP,這說明NRG-ErbB4信號對杏仁核LTP的調控無通路選擇性。
　　 由于阻斷GABAA受體或NRG1/ErbB4通路均可增強外側杏仁核區(qū)中LTP的產生,所以我們認為,NRG1/E

14、rbB4通路的阻斷劑可能是通過降低GABA能抑制從而增強了LTP。為了驗證這一假說,我們比較了單獨灌流20 μM BMI與同時灌流20 μM BMI和2μg/ml ecto-ErbB4兩種不同情況下所誘導LTP的幅度,以此觀察兩者之間是一種協同作用還是一種相互疊加的作用。我們發(fā)現這兩種方式處理后都可以誘導出LTP,并且同時灌流BMI和ecto-ErbB4組與單獨灌流BMI組所誘導的LTP幾乎相同。單獨灌流BMI組所誘導的LTP幅度為11

15、9.234±1.61％(n=6),同時灌流BMI和ecto-ErbB4組為120.76±5.68％(n=8),兩組之間無統計學差異。
　　 我們進一步觀察了ecto-ErbB4對基礎興奮性突觸傳遞的影響。我們分別在加藥前與加藥20分鐘后記錄了fEPSP的輸入輸出曲線(I-O),發(fā)現ecto-ErbB4對I-O曲線沒有影響。并且,加藥前后的PPF(雙脈沖易化,反映突觸前的機制)同樣也無顯著性差異。
　　 隨后,我們使用了一

16、種ErbB4受體敲除鼠(ErbB4-/-HER4heart),以此進一步證明NRG1-ErbB4通路對外側杏仁核的GABA能系統及LTP誘導的調控作用。首先我們比較了敲除鼠與野生型鼠中所記錄的最大IPSC的差異。與野生型鼠相比(809.10±83.69pA,n=12),雖然ErbB4-/-HER4heart鼠顯示了更小的IPSC幅度(619.09±72.65pA,n=18),但兩者之間無統計學的差異(P>0.05,獨立樣本T檢驗)。與野

17、生型相反,敲除鼠IPSC的I-O曲線落到了EPSC I-O曲線的下方。更重要的是,敲除鼠的IPSC/EPSC比值明顯小于野生型(在15,20,25,30,35,40,50V刺激強度下,P<0.05,獨立樣本T檢驗)。
　　 接下來,我們進一步比較了ErbB4敲除鼠與野生型之間LTP的差別。我們同樣選擇了丘腦傳入給以強直刺激,刺激后在野生型鼠中記錄到的fEPSP的幅度為基線的105.93±5.09％(n=7)。于此相反,在ErbB

18、4-/-HER4heart敲除小鼠中可以誘導出幅度為121.94±3.42％的LTP(n=6),明顯大于野生型(P<0.05)。此外,我們又在敲除鼠的腦片中加入BMI,以此觀察其是否可進一步增加LTP,結果顯示LTP的幅度為119.22±4.76％(n=5),與未處理敲除鼠相比無顯著性差異。
　　 綜上所述,我們的研究結果提示,外側杏仁核相對飽和的NRG1/ErbB4信號通路參與維持高水平的GABA能系統,進而阻止了LTP的產生