酵母朊蛋白Sup35NM及其變異體體外淀粉樣纖維形成動(dòng)態(tài)及其細(xì)胞毒性作用.pdf

1、本文為明確N區(qū)特殊的氨基酸組成及序列在淀粉樣纖維形成中的作用，構(gòu)建了Sup35NM的變異體，分析了它們淀粉樣纖維形成的動(dòng)力學(xué)過(guò)程，并進(jìn)一步探討了野生型Sup35NM及其變異體聚集物的細(xì)胞毒性作用，以期為闡明淀粉樣纖維形成及其致病機(jī)制提供線(xiàn)索。 1.酵母朊蛋白Sup35NM變異體體外淀粉樣纖維形成的動(dòng)態(tài)研究為了闡明氨基酸序列對(duì)纖維形成的影響，首先將Sup35NM片段的PrD的氨基酸序列重新隨機(jī)排列同時(shí)保證氨基酸的組成及M段的氨基酸

2、序列不變，構(gòu)建了5個(gè)Sup35NM的變異體，分別稱(chēng)為Sup35NM-1、-2、-3、-4、-5。在E. coli中成功表達(dá)、純化了野生型Sup35 NM及其5個(gè)變異體，進(jìn)而研究了其在體外淀粉樣纖維形成的動(dòng)力學(xué)過(guò)程。結(jié)果顯示：透射電子顯微鏡下觀(guān)察可見(jiàn)Sup35NM及其5種變異體蛋白在PBS(pH7.4)緩沖液中均可發(fā)生聚集，2h時(shí)可見(jiàn)球形顆粒、寡聚體及少量短而細(xì)的纖維，18h時(shí)Sup35NM、Sup35NM.1、-2、-3蛋白溶液中出現(xiàn)大

3、量的成熟纖維，球形顆粒消失，纖維長(zhǎng)且邊緣光滑，Sup35NM-4、-5除了長(zhǎng)纖維以外，還可見(jiàn)蛋白寡聚體和球形顆粒。48h后，Sup35NM及5個(gè)變異體蛋白溶液中只有大量成熟纖維，直徑約8～14 nm。用圓二色譜檢測(cè)了其二級(jí)結(jié)構(gòu)，顯示在216nm附近出現(xiàn)一負(fù)峰，呈典型的β-折疊特征，提示該過(guò)程伴隨蛋白結(jié)構(gòu)由α-螺旋到β-折疊的轉(zhuǎn)變。NM及變異體聚集所形成的纖維分別經(jīng)1μg/ml和4μg/ml的蛋白酶K作用60min后仍可檢測(cè)到蛋白的存在，

4、說(shuō)明纖維具有較強(qiáng)的抗蛋白酶K消化的特性。ThT結(jié)合試驗(yàn)顯示，Sup35NM-1、-2、-3與Sup35NM熒光強(qiáng)度上升的速度相似，經(jīng)歷一個(gè)快速上升期后達(dá)到平臺(tái)期，未見(jiàn)明顯的潛伏期，而Sup35NM-4、-5則能觀(guān)察到一個(gè)近5h的潛伏期，提示Sup35NM-4、-5蛋白聚集明顯慢于Sup35NM及其它變異體蛋白。SDS-PAGE電泳和Westem blotting也進(jìn)一步證明，纖維形成過(guò)程中蛋白單體逐漸減少同時(shí)多聚體則逐漸增加。淀粉樣纖維

5、經(jīng)沸水浴加熱后發(fā)現(xiàn)纖維消失，代之以大量的球形顆粒、寡聚體及少量短棒狀纖維，ThT結(jié)合試驗(yàn)顯示纖維加熱后熒光強(qiáng)度明顯下降，SDS-PAGE電泳也證實(shí)加熱后蛋白單體重新出現(xiàn)。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明PrD的氨基酸序列被隨機(jī)打亂后并沒(méi)用影響其最終形成淀粉樣纖維的能力，并且變異體形成的纖維具有與野生型Sup35NM的纖維具有相同的形態(tài)和生化特征，但纖維形成的速率有所不同，提示形成纖維的能力是由氨基酸組成決定的，特定的氨基酸序列在一定程度上調(diào)節(jié)纖維形成的速率

6、。 2.野生型Sup35NM及其變異體蛋白纖維的構(gòu)象誘導(dǎo)轉(zhuǎn)變作用已有研究表明，在體內(nèi)Rnqlp、polyQ等聚集體可誘導(dǎo)酵母菌株從[PSI<'->]轉(zhuǎn)變?yōu)閇PSI<'+>]，在體外異源性的Rnql或polyQ“種子”可促進(jìn)NM形成淀粉樣纖維。我們構(gòu)建的變異體N區(qū)同野生型NM一樣富含Q/y，為了進(jìn)一步闡明富含Q/N的異源性“種子”能促進(jìn)蛋白的聚集，我們研究了野生型NM與變異體的相互誘導(dǎo)轉(zhuǎn)變以及另一個(gè)酵母朊蛋白Ure2對(duì)NM和變異體

7、纖維形成的影響。結(jié)果顯示：野生型Sup35NM“種子”可加快變異體Sup35NM-1、-4、-5的纖維形成，反之亦然。此外，異源的Ure2“種子”也能輕度增加NM及變異體的轉(zhuǎn)變速率，但總的來(lái)說(shuō)異源性的“種子”比自體“種子”的誘導(dǎo)效率相對(duì)低一些。而沒(méi)有Q/N結(jié)構(gòu)域的α-synuclein“種子”則對(duì)蛋白聚集的速率無(wú)影響。這些結(jié)果提示富含Q/N結(jié)構(gòu)域的異源性“種子”盡管其氨基酸序列不同，能夠促進(jìn)同樣含有Q/N結(jié)構(gòu)域的蛋白的聚集，而不含Q/N

8、的異源“種子”則無(wú)此作用。 3.野生型Sup35NM及其變異體對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的毒性目前已有大量研究證實(shí)，在多種蛋白聚集過(guò)程中形成的中間體有細(xì)胞毒性。Sup35p是釀酒酵母中的朊蛋白，可發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變形成淀粉樣纖維，與哺乳動(dòng)物Prion蛋白不同，不會(huì)引起酵母死亡，與人類(lèi)淀粉樣疾病無(wú)關(guān)，Sup35的聚集中間體是否具有細(xì)胞毒性作用還沒(méi)有得到證實(shí)。為證實(shí)Sup35NM聚集體的細(xì)胞毒性，我們將純化的蛋白(64μmol/L)于室溫下放置0.5

9、～1h或于4℃放置2d～4d后，分別獲得聚集中間體和成熟纖維，然后將不同形態(tài)的蛋白分別作用于Vero、NIH-3T3、SH-SY5Y細(xì)胞系。此外，研究了變異體的毒性作用。結(jié)果顯示：Sup35NM及其變異體的聚集中間體對(duì)細(xì)胞具有毒性作用，可明顯降低細(xì)胞存活率，這種毒性作用與劑量具有相關(guān)性，成熟纖維反而無(wú)害，與其它蛋白相似。這一結(jié)果提示蛋白聚集體的細(xì)胞毒性可能與其結(jié)構(gòu)相關(guān)。不同細(xì)胞系對(duì)蛋白毒性的敏感性有差異，Vero和NIH-3T3細(xì)胞比較