H102抑制β-淀粉樣蛋白聚集和纖維形成的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景: 阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一種神經(jīng)退行性疾病，其發(fā)病率隨年齡的增大而逐年增加，隨著人口老齡化進(jìn)程的加快，老年性疾病已成為一個(gè)明顯影響人類(lèi)健康的突出問(wèn)題。阿爾茨海默病和心臟病、癌癥和中風(fēng)并列為威脅人類(lèi)健康的四大疾病。而現(xiàn)有的治療方法如神經(jīng)遞質(zhì)替代、神經(jīng)生長(zhǎng)因子和腦細(xì)胞活化劑等的治療，主要是改善癥狀，延緩病情發(fā)展，尚未取得令人滿(mǎn)意的效果。尋找針對(duì)病因的治療藥物，是AD治療的關(guān)鍵。β-淀粉樣

2、蛋白（β-Amyloid protein，Aβ）是老年斑（Senile Plaques，SP）中的主要成份，它的聚集被認(rèn)為是導(dǎo)致阿爾茨海默發(fā)病的始發(fā)因素。以Aβ為靶的治療策略是指導(dǎo)藥物研究的一個(gè)極具希望的方向，它有別于以改善神經(jīng)元功能或臨床癥狀為主的治療方法，而是針對(duì)引起AD發(fā)病的病理因素進(jìn)行治療。本研究根據(jù)Aβ1-42的化學(xué)結(jié)構(gòu)、形成過(guò)程和聚集原理設(shè)計(jì)出6種具有所期望的穩(wěn)定性、溶解性和活性的多肽抑制劑，用于阻止可溶性β-淀粉樣蛋白寡聚

3、體和β-淀粉樣蛋白斑塊的形成。再通過(guò)以Aβ為靶進(jìn)行的藥物篩選，確定出H102，并在體外觀察其對(duì)Aβ聚集的影響和對(duì)Aβ誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用以及腦室注射H102對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)淀粉樣前體蛋白（Amyloid Precursor Protein，APP）、Aβ表達(dá)的影響，為H102作為抗AD藥物開(kāi)發(fā)提供了重要的前期實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 本研究共分為三個(gè)部分：（一）分子水平藥物篩選及H102對(duì)Aβ1-42聚集的影響；（二）細(xì)胞水平藥物篩選及

4、H102對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)作用；（三）H102對(duì)APP轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)APP和Ap表達(dá)的影響。 材料和方法: （一）分子水平藥物篩選及H102對(duì)Aβ1-42聚集的影響 1.藥物篩選 將上述6種多肽抑制劑和維生素E（Vitamin E，VE）在相同劑量（88.61μmol/L）和孵育條件下（37℃24h）與Aβ1-42（22.15μmol/L）共同孵育，取樣進(jìn)行Th-T檢測(cè)，比較6種藥物干預(yù)Aβ1-42聚

5、集的差別。 2.H102抑制Aβ聚集的研究 2.1量效關(guān)系研究用不同濃度（20μmol/L，40μmol/L，88.61μmol/L，200μmol/L）的H102和VE各10μl與（22.15μmol/L）的Aβ1-4210μl在37℃24h條件下共同孵育，取樣做Th-T檢測(cè)，以研究其抑制Aβ聚集的量效關(guān)系曲線(xiàn)變化。 2.2時(shí)效關(guān)系研究Aβ1-4210μl分別加入H102或VE各10μl（Aβ終濃度為11.07

6、μmol/L，H102和VE終濃度為44.30μmol/L）37℃共同孵育，分別于孵育的12h、1d、3d、Sd、7d取樣作Th-T檢測(cè)，分析其干預(yù)Aβ聚集的時(shí)效關(guān)系曲線(xiàn)變化。 3.電鏡觀察驗(yàn)證藥物 將上述6種多肽抑制劑在相同劑量（88.61μmol/L）和孵育條件下（37℃5d）與Aβ1-42（22.15μmol/L）共同孵育。作透射電鏡觀察Aβ單獨(dú)孵育后的聚集以及藥物干預(yù)后對(duì)Aβ聚集、纖維形成的影響。 （二）

7、細(xì)胞水平藥物篩選及H102對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)作用 體外培養(yǎng)SY5Y細(xì)胞，以MTT代謝率測(cè)定細(xì)胞存活率作為篩選指標(biāo)，篩選出具有保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞SY5Y作用的多肽抑制劑。 1.多肽抑制劑對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)作用 分為正常對(duì)照組、多肽抑制劑K7、L5、H100、H101、H102、H10310μmol/L組、20μmol/L組、40μmol/L組； 2.多肽抑制劑對(duì)Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的保護(hù)作用 分為正常對(duì)照

8、組、Aμ1-42損傷組、Aβ1-42+多肽抑制劑K7、L5、H100、H101、H102、H10310μmol/L組、20μmol/L組、40μmol/L組； 3.H102的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用實(shí)驗(yàn) 分為對(duì)照組、20μmol/L H102組； 4.H102的神經(jīng)保護(hù)作用實(shí)驗(yàn) 分為對(duì)照組、Aβ1-42損傷組、Aβ1-42+H102組。以MTT代謝率測(cè)定細(xì)胞存活率、細(xì)胞計(jì)數(shù)觀察細(xì)胞增長(zhǎng)情況、LDH漏出率觀察細(xì)胞死亡率

9、和形態(tài)學(xué)觀察H102對(duì)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。 （三）H102對(duì)APP轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi) APP和Aβ表達(dá)的影響 APP轉(zhuǎn)基因小鼠，給予H102側(cè)腦室注射3μl/d，10d后，運(yùn)用剛果紅和神經(jīng)免疫組織化學(xué)技術(shù)方法染色，測(cè)定模型動(dòng)物腦內(nèi)APP、Aβ的表達(dá)水平。 結(jié)果: （一）分子水平藥物篩選及H102對(duì)Aβ1-42聚集的影響 1.藥物篩選初步分析 以老化組的去本底熒光強(qiáng)度為100%，計(jì)算出各組藥物

10、對(duì)Aβ1-42的聚集和纖維形成的抑制率。最后選擇對(duì)Aβ具有良好抑制聚集和纖維形成的H102進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)分析。 2.H102藥效學(xué)研究 H102和VE可以明顯抑制Aβ1-42的聚集，對(duì)Aβ聚集的抑制均有濃度依賴(lài)性，H102在每一濃度點(diǎn)的抑制率均大于VE；時(shí)效依賴(lài)關(guān)系顯示給藥各組各時(shí)間點(diǎn)熒光強(qiáng)度均較Aβ組明顯減弱，以H102的減弱最明顯。曲線(xiàn)半高峰出現(xiàn)時(shí)間（T1/2），Aβ在給藥后第3天，而H102和VE則推遲至第4天

11、左右。 3.電鏡觀察 Aβ1-42在PBS溶液中單獨(dú)孵育具有自發(fā)聚集傾向：?jiǎn)为?dú)孵育37℃5d，有大量Aβ纖維形成，直徑約8～10nm，長(zhǎng)0.5～5μm，呈芒刺式晶狀聚集，有分枝，甚至交織成網(wǎng)狀，其間夾雜著少量呈聚集狀態(tài)的無(wú)定形結(jié)構(gòu)；K7與Aβ1-42共同孵育5d，出現(xiàn)大量Aβ纖維，直徑約10～12nm，長(zhǎng)0.5～3μm，呈芒刺式晶狀聚集，有分枝，有交織成網(wǎng)狀的趨勢(shì)，其間可見(jiàn)大量呈聚集狀態(tài)的無(wú)定形結(jié)構(gòu)；L5與Aβ1-42

12、孵育5d，形成的Aβ纖維明顯較細(xì)，直徑約4～8nm，長(zhǎng)0.3～5μm，交織成網(wǎng)狀，其間夾雜著極少量呈聚集狀態(tài)的無(wú)定形結(jié)構(gòu)；H100與Aβ1-42孵育5d，形成大量Aβ纖維，直徑約10～18nm，長(zhǎng)0.3～3μm，有交織成網(wǎng)狀的趨勢(shì)，可見(jiàn)大量呈聚集狀態(tài)的無(wú)定形結(jié)構(gòu)；H101與Aβ共同孵育5d，有少量Aβ纖維形成，直徑約5～8nm，長(zhǎng)0.5～5μm，交織成網(wǎng)狀，其間可見(jiàn)極少量呈聚集狀態(tài)的無(wú)定形結(jié)構(gòu)；H102與Aβ共同孵育5d，Aβ纖維形成明

13、顯減少且直徑變細(xì)，約3～6nm，長(zhǎng)0.3～3μm，交織成網(wǎng)狀，其間夾雜著極少量呈聚集狀態(tài)的無(wú)定形結(jié)構(gòu)；H103與Aβ共同孵育5d，少量Aβ纖維形成，直徑約5～8nm，長(zhǎng)0.5～5μm，呈芒刺式晶狀聚集，交織成網(wǎng)狀，其間夾雜著少量呈聚集狀態(tài)的無(wú)定形結(jié)構(gòu)?？梢?jiàn)，H102抑制Aβ聚集和纖維形成的效果最好。 （二）細(xì)胞水平藥物篩選及H102對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)作用 6種多肽抑制劑中有4種可使SY5Y細(xì)胞MTT代謝率增高，以H1

14、02的效果最好，可使SY5Y細(xì)胞MTT代謝率增高，LDH漏出率減少，細(xì)胞數(shù)量增加。Aβ1-42對(duì)培養(yǎng)的神經(jīng)元具有毒性作用，表現(xiàn)為抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，MTT代謝率下降。6種多肽抑制劑都可以減輕Aβ1-42引起的神經(jīng)元損傷，以H102效果最明顯，可使MTT代謝率升高，LDH漏出率減少，細(xì)胞數(shù)量增加，死細(xì)胞減少。提示H102具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)作用。 （三）H102對(duì)APP轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)APP和Aβ表達(dá)的影響 9月齡轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分組

15、分為模型組、藥物注射組、同月齡同背景C57BL/6J小鼠正常對(duì)照。藥物注射組側(cè)腦室給藥，其他兩組小鼠注射等體積生理鹽水，給藥10次后處死取鼠腦檢測(cè)：石蠟切片觀察剛果紅染色；免疫組化觀察APP、Aβ改變。提示H102可以降低APP轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)APP、Aβ表達(dá)水平。 結(jié)論 藥物篩選出H102對(duì)Aβ的β-折疊、聚集、纖維形成有很強(qiáng)的干預(yù)作用，并且對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)作用。具體表現(xiàn)在：（1）干預(yù)Aβ聚集、纖維形成過(guò)程；（2