乙型肝炎病毒C基因熱點(diǎn)變異與細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答的體外研究.pdf

1、HBV是一種嗜肝DNA病毒，部分雙鏈環(huán)狀，大約由3200個(gè)堿基對組成，含有四個(gè)部分重疊的開放讀框，編碼外膜蛋白[前-S1，前S2和HBV表面抗原(hepatitisBvirussurfaceantigen，HBsAg)]、核殼蛋白[HBV核心抗原(hepatitisBviruscoreantigen，HBcAg)，e抗原(hepatitisBviruseantigen，HBeAg)]、轉(zhuǎn)式激活蛋白(X)和多聚酶蛋白(P)。宿主感染HBV

2、可能有幾種不同的臨床過程和結(jié)果，包括急性自限性肝炎、暴發(fā)性肝炎、慢性活動(dòng)性肝炎(CAH)、肝硬化、急性加重的肝衰竭和無癥狀健康攜帶者(AsC)。HBV非直接致細(xì)胞病變，HBV感染者肝損傷是由于免疫應(yīng)答介導(dǎo)的。 細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(cytotoxicTlymphocyte，CTL)在機(jī)體抵抗各類病毒感染和/或?qū)е旅庖卟±頁p傷中起著極為重要的作用，HBVC基因編碼183-185個(gè)氨基酸的核殼蛋白，含有抗原特異性CTL識(shí)別表位，當(dāng)HBc

3、Ag多肽表達(dá)在肝細(xì)胞膜表面時(shí)，誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答對于殺傷病毒感染的肝細(xì)胞起到至關(guān)重要的作用。 HBV是高度變異的，野生病毒在復(fù)制過程中為適應(yīng)環(huán)境改變，常可發(fā)生基因差異或基因變異，形成毒株群體的異質(zhì)性。HBcAg的第48-60、84-101和147-155位氨基酸序列是CTL識(shí)別的表位，常出現(xiàn)聚集變異，常見的是AA60的亮氨酸被纈氨酸替代(L60V)、AA87的絲氨酸被甘氨酸替代(S87G)和AA97的異亮氨酸被亮氨酸替代(I97

4、L)。病毒變異甚至抗原表位上單個(gè)氨基酸的替代就能抑制其與HLA的結(jié)合、或者減弱T細(xì)胞受體(TCR)對抗原肽的識(shí)別，進(jìn)而影響CTL應(yīng)答。變異熱點(diǎn)聚集于某一區(qū)段，提示該區(qū)段可能會(huì)發(fā)生相應(yīng)功能的改變，產(chǎn)生與野生型不同的生物學(xué)效應(yīng)。 如果要研究HBV特異性CTL活性，必須在體外用HLA相容的轉(zhuǎn)染體穩(wěn)定刺激增殖HBV特異性的CTL，建立穩(wěn)定的CTL刺激細(xì)胞和靶細(xì)胞系統(tǒng)。急、慢性HBV感染者病人的外周血中HBV特異性CTL前體數(shù)量太低，不能

5、直接被檢測到；而且HBV不能在體外直接感染，產(chǎn)生表達(dá)HBV基因產(chǎn)物的刺激細(xì)胞和靶細(xì)胞受HLA抗原限制，必須通過高效率的基因轉(zhuǎn)染方法獲得。因此，我們用定點(diǎn)突變的方法將攜帶1.2拷貝的HBV(adr亞型)全基因組的p3.8Ⅱ質(zhì)粒C基因區(qū)進(jìn)行突變，插入EBO-plpp真核細(xì)胞表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染慢性HBV感染者EBV永生化的B淋巴母細(xì)胞系，經(jīng)潮霉素篩選后能穩(wěn)定表達(dá)，用于分析慢性HBV感染C基因變異對CTL應(yīng)答的影響，以了解慢性HBV感染過程中病毒清

6、除和肝細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制。 第一部分慢性乙型肝炎感染者EBV轉(zhuǎn)化的B淋巴母細(xì)胞系建立 EpsteinBarr病毒(EBV)是一種廣泛存在的人類皰疹病毒，在體外能夠高效率感染外周血中靜止的B淋巴細(xì)胞，使其永生化成為有增殖能力的B淋巴母細(xì)胞系(LCLs)，將HBV特異性抗原編碼的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到LCLs中穩(wěn)定表達(dá)，由于能夠分裂增殖、易傳代和長期培養(yǎng)，為體外進(jìn)行免疫學(xué)和遺傳學(xué)研究提供了良好的細(xì)胞來源。 1.PBMC采集

7、和EpsteinBarr病毒的制備 血清學(xué)確診的慢性HBV感染者46例(CAH31例，AsC15例)，無菌采集外周靜脈血30ml，肝素抗凝，等體積PBS稀釋混勻；淋巴細(xì)胞分離液lymphoprepTM密度梯度分離，收集中間層乳白色混懸液為外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)層，細(xì)胞計(jì)數(shù)后備用。 將產(chǎn)生EBV的B95-8細(xì)胞密度調(diào)整為1×106個(gè)/ml，用10ml的完全RPMI-1640培養(yǎng)基(10％胎牛血清)，移入培養(yǎng)瓶中，37

8、℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)期間不需更換和補(bǔ)充培養(yǎng)液，12～14d后離心收集細(xì)胞，反復(fù)凍融，使細(xì)胞裂解后收集培養(yǎng)上清，此時(shí)上清中可含有高滴度的EB病毒，液氮中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?2.建立永生化的B淋巴母細(xì)胞系 用1mlEBV上清感染1×106個(gè)PBMC，加入含有2μg/mlCyA，2.5μg/mlCpG的完全RPMI-1640培養(yǎng)液，定期按1∶1體積半換液，3～4周后即可獲得無限生長的細(xì)胞系LCLs，永生化的LCLs細(xì)胞形態(tài)

9、呈母細(xì)胞樣改變，體積增大，胞質(zhì)豐富，呈球狀，增殖的細(xì)胞集落，懸浮或貼壁生長。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測LCLs細(xì)胞表面標(biāo)志CD19和CD23。表達(dá)CD19和CD23分子陽性細(xì)胞分別為94±2.7和90.2±4.7(％，X±SDn=42)。CD19是所有B細(xì)胞共有的表面標(biāo)志，B細(xì)胞活化后亦不消失；CD23主要存在于激活的B細(xì)胞表面，是B細(xì)胞活化的標(biāo)志，可根據(jù)B細(xì)胞表面CD23表達(dá)與否來判斷B細(xì)胞能否在體外長期培養(yǎng)。46例PBMC中，42例LCLs

10、轉(zhuǎn)化成功，成功率為91.3％。凍存和復(fù)蘇后增殖活性、細(xì)胞形態(tài)和生物學(xué)特性未改變。 第二部分乙型肝炎病毒全基因組C區(qū)突變株在B淋巴母細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá) 在慢性HBV感染中，C基因的變異大部分多數(shù)集中在AA48-60、AA84-101和AA147-155的3個(gè)小段序列的聚集變異，比其它部位有較高的替代率。我國的慢性乙型肝炎病人常在這些區(qū)段出現(xiàn)變異。在這些聚集變異中，更常見的是常見的是AA60的亮氨酸被纈氨酸替代(L60V)、A

11、A87的絲氨酸被甘氨酸替代(S87G)和AA97的異亮氨酸被亮氨酸替代(I97L)，HBcAg在關(guān)鍵位置上個(gè)別核苷酸的點(diǎn)突變造成的錯(cuò)義變異，可影響病毒的復(fù)制和病毒蛋白的表達(dá)，產(chǎn)生與野生型不同的生物學(xué)效應(yīng)。本文采用定點(diǎn)突變和基因重組技術(shù)構(gòu)建含1.2拷貝的HBV(adr亞型)全基因組L60V、S87G、I97L突變質(zhì)粒真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染病人自體永生化的LCLs，并穩(wěn)定表達(dá)，為研究HBVC基因熱點(diǎn)變異的生物學(xué)意義提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

12、 第三部分乙型肝炎病毒核心區(qū)熱點(diǎn)變異與CTL應(yīng)答的體外研究 一系列的研究表明，肝細(xì)胞的損傷是由于HBV介導(dǎo)的免疫應(yīng)答引起的，HLA-Ⅰ類分子限制的CTL應(yīng)答是清除HBV感染的決定因素。本研究用EBO-HBV全基因組C基因突變株質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染自體永生化LCLs，作為分析CTL細(xì)胞毒性的刺激細(xì)胞和靶細(xì)胞，體外誘導(dǎo)病人PBMC中的CTL，分析9例CAH病人和5例AsC病人在相同的HLA背景下，HBV野生株和變異株特異性的CTL應(yīng)答作用。