乙醇對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞黏著斑激酶的影響及其細(xì)胞毒性作用.pdf

1、我國(guó)酒文化源遠(yuǎn)流長(zhǎng)，但隨著飲酒在社會(huì)交往活動(dòng)中更加頻繁，飲酒所帶來(lái)的社會(huì)問(wèn)題也日益凸顯。近年來(lái)飲酒后傷害案件屢見(jiàn)不鮮，加之案情復(fù)雜，給檢案人員造成很大壓力。早在1963年有國(guó)外法醫(yī)提出外傷性蛛網(wǎng)膜下腔出血(traumatic subarachnoid hemorrhage，tSAH)與酗酒有關(guān)，實(shí)際檢案過(guò)程發(fā)現(xiàn)酒后受到輕微外力作用，顱內(nèi)出血的發(fā)病率和死亡率明顯增高。雖然已知飲酒可以調(diào)節(jié)心率和局部血流，改變血管通透性，影響血管舒縮功能，破

2、壞凝血、抗凝血平衡，但這些改變尚不足以解釋飲酒后外力作用易于引發(fā)顱內(nèi)出血的原因。此外，長(zhǎng)期困擾法醫(yī)工作者的難題是:如何界定飲酒和外力各自的參與度，進(jìn)而判定案件性質(zhì)。所以更深入地研究飲酒易于造成腦血管破裂出血機(jī)制，有助于指導(dǎo)法醫(yī)實(shí)踐、改進(jìn)檢案思路和明確判定結(jié)果。
　　乙醇(ethanol，EtOH)又名酒精，是酒類(lèi)飲品中的主要成分。飲酒后乙醇可以以原型形式進(jìn)入血液，血乙醇濃度(blood alcohol concentration，

3、BAC)快速升高，乙醇隨血流遍布全身。內(nèi)皮細(xì)胞(endotheilial cell，EC)位于血管腔面最內(nèi)側(cè)，直接接觸血液中乙醇及其代謝產(chǎn)物;另一方面內(nèi)皮細(xì)胞生物功能活躍，擁有乙醇代謝相關(guān)酶體參與乙醇代謝，這就決定了內(nèi)皮細(xì)胞可能遭受乙醇的直接和間接毒性作用，成為乙醇首當(dāng)其沖的損傷靶點(diǎn)。
　　由于血管內(nèi)皮承擔(dān)著重要的血管調(diào)節(jié)功能，在物質(zhì)交換、血管張力調(diào)控、凝血、血管發(fā)生、白細(xì)胞游走等多種生物過(guò)程中發(fā)揮不可替代的作用;并可以“感知”血

4、流切應(yīng)力、周期應(yīng)力等各種機(jī)械應(yīng)力及各種血液成分改變，協(xié)調(diào)其他細(xì)胞共同作出相應(yīng)反應(yīng)，所以乙醇引起的內(nèi)皮細(xì)胞損傷會(huì)危及到整個(gè)血管系統(tǒng)。
　　其中腦血管具有其他部位血管不可比擬的自主調(diào)控能力以保持穩(wěn)定的腦灌流量，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷愈發(fā)敏感。本課題以?xún)?nèi)皮細(xì)胞作為主要研究對(duì)象，探索乙醇的血管毒性作用，為進(jìn)一步研究飲酒后輕微外力引發(fā)蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)的機(jī)制做好鋪墊。
　　血管內(nèi)皮以單層細(xì)

5、胞形式分布，其結(jié)構(gòu)、功能完整性特別依賴(lài)于與細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的連接、交流。黏著斑復(fù)合體是細(xì)胞與ECM連接處的復(fù)合結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞骨架與ECM的連接。一方面它可以將細(xì)胞外的信號(hào)傳入胞內(nèi)，通過(guò)“引導(dǎo)”應(yīng)力纖維分布實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞形態(tài)、功能的調(diào)整;另一方面將細(xì)胞生命活動(dòng)產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)牽引力(tractionforce)傳遞到ECM，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為生物信號(hào)傳遞給周?chē)?xì)胞，使機(jī)體能作出及時(shí)的宏觀(guān)調(diào)整。
　　黏

6、著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)是黏著斑復(fù)合體重要的組成成分。一方面FAK受到integrin聚集、生長(zhǎng)因子受體連接、切應(yīng)力等多種因素調(diào)節(jié)活化;另一方面FAK可以連接并激活其他黏著斑結(jié)構(gòu)蛋白，參與黏著斑復(fù)合體形成與成熟，調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附、遷移等基本功能，還可以招募多種功能蛋白，參加到不同的信號(hào)通路調(diào)節(jié)中去?，F(xiàn)已證實(shí)FAK在內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)揮著舉足輕重的作用。用特異失活內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)FAK的方法研究胚胎發(fā)育，發(fā)現(xiàn)FAK失

7、活的胚胎雖然早期發(fā)育正常，但是在胚胎發(fā)育晚期出現(xiàn)胚胎、卵黃囊和胎盤(pán)的血管發(fā)育異常，內(nèi)皮細(xì)胞死亡增多，血管破裂進(jìn)而出現(xiàn)出血、水腫。多種疾病中也發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞FAK表達(dá)、活化異常。對(duì)于過(guò)量乙醇刺激對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞FAK的影響及相應(yīng)的生物學(xué)意義尚缺乏研究。本研究將著眼于過(guò)量乙醇對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞FAK的影響，探討乙醇血管毒性的相關(guān)機(jī)制。
　　第一部分、乙醇對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的毒性作用
　　目的:本部分將從動(dòng)物整體水平和體外細(xì)胞水平觀(guān)察乙醇對(duì)血管的毒性作用

8、，全面研究乙醇對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的影響。
　　方法:
　　1.采用灌胃器給酒制備大鼠飲酒模型，檢測(cè)飲酒后BAC變化。運(yùn)用Masson三色染色和透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM)技術(shù)觀(guān)察不同飲酒時(shí)間大鼠腦實(shí)質(zhì)毛細(xì)血管和基底動(dòng)脈形態(tài)改變;
　　2.給予人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)不同濃度、

9、不同時(shí)間的乙醇刺激，利用MTT檢測(cè)HUVEC存活率，反映乙醇的細(xì)胞毒性;
　　3.利用流式細(xì)胞術(shù)觀(guān)測(cè)乙醇誘導(dǎo)的HUVCE凋亡;
　　4.用光鏡、掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope，SEM)和TEM觀(guān)察乙醇引起的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)改變;
　　5.待乙醇干預(yù)結(jié)束后用胰酶替代物消化HUVEC，重新接種于纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）包被的培養(yǎng)板中，測(cè)量1-2h內(nèi)的粘附率和粘附

10、過(guò)程中細(xì)胞鋪展的面積以評(píng)價(jià)內(nèi)皮細(xì)胞粘附能力;利用特異阻斷抗體預(yù)處理細(xì)胞實(shí)現(xiàn)整合素（integrin）阻斷后，進(jìn)行粘附實(shí)驗(yàn)，觀(guān)察integrin在其中作用;
　　6.給予乙醇干預(yù)后，利用劃痕實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)乙醇對(duì)HUVEC遷移能力的影響。
　　結(jié)果:
　　1.短期飲酒大鼠腦內(nèi)既可見(jiàn)明顯血管源性水腫，毛細(xì)血管周?chē)g隙明顯增大，內(nèi)皮細(xì)胞微絨毛減少，胞質(zhì)內(nèi)線(xiàn)粒體空泡化;
　　2.長(zhǎng)期飲酒大鼠基底動(dòng)脈中膜平滑肌成分與外膜膠原成分增

11、多，壁/腔比明顯增大(p＜0.05)，并可見(jiàn)內(nèi)皮細(xì)胞脫落;
　　3.乙醇使內(nèi)皮細(xì)胞生存率呈劑量、時(shí)間依賴(lài)性下降，與對(duì)照組相比出現(xiàn)較多早期凋亡細(xì)胞(p＜0.05)，這些凋亡細(xì)胞在TEM下呈現(xiàn)出細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則，核染色質(zhì)邊集呈半月?tīng)钋译娮用芏仍龈?，?xì)胞胞漿減少等征象;
　　4.光鏡、SEM、TEM觀(guān)察可見(jiàn)乙醇刺激使HUVEC失去正常形態(tài)，胞內(nèi)細(xì)胞器表現(xiàn)出空泡化等損傷征象;
　　5.乙醇明顯降低HUVEC粘附率(p＜0.05

12、)和平均細(xì)胞鋪展面積(p＜0.05)。特異integrinβ1抗體預(yù)處理后可以降低正常組細(xì)胞粘附率，但對(duì)乙醇組影響不明顯;
　　6.乙醇明顯降低HUVEC單細(xì)胞層劃痕的愈合速度(p＜0.05)。
　　小結(jié):在體和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均證明過(guò)量乙醇具有明顯的內(nèi)皮毒性作用，影響內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)、降低生存率、抑制其與ECM粘附及粘附后鋪展，以及降低內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力;乙醇作用后HUVEC粘附力下降可能與integrin信號(hào)通路有關(guān)。
　　第二

13、部分、過(guò)量乙醇對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞黏著斑激酶的影響及其產(chǎn)生機(jī)制
　　目的:本部分將系統(tǒng)研究過(guò)量乙醇對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞中FAK分布、蛋白表達(dá)及磷酸化的影響，并探討相關(guān)機(jī)制。
　　方法:
　　1.用細(xì)胞免疫熒光標(biāo)記細(xì)胞粘附、鋪展和遷移過(guò)程中的磷酸化的FAK酪氨酸397位點(diǎn)(phosphorylated FAK at Tyr397，pFAK Y397)，觀(guān)察黏著斑復(fù)合體分布變化;
　　2.利用western blot檢測(cè)乙醇作用對(duì)FAK

14、總蛋白水平和磷酸化水平的影響;
　　3.給予HUVEC特異乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase，ADH)抑制劑4-甲基吡唑(4-methyle-pyrazole，4MP)預(yù)孵或給予乙醇主要的代謝產(chǎn)物乙醛(acetaldehyde，Ach)刺激，研究乙醇代謝在FAK變化中的作用;
　　4.利用活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)特異探針DCFH-DA標(biāo)記ROS觀(guān)察乙醇、乙醛引起的

15、氧化應(yīng)激變化;
　　5.給予外源性過(guò)氧化氫(H2O2)或非特異性?xún)?nèi)源性ROS清除劑N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)，研究氧化應(yīng)激在FAK變化中的作用。
　　結(jié)果:
　　1.乙醇并未影響integrinβ1的表達(dá)和分布;
　　2.在鋪展過(guò)程中的對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)pFAK Y397形成較大的片狀分布，尤以細(xì)胞邊緣明顯，遷移過(guò)程中細(xì)胞遷移方向的前緣亦可形成大片狀pFAK Y397表達(dá);

16、而過(guò)量乙醇干預(yù)過(guò)的HUVEC中形成的片狀結(jié)構(gòu)小而少;
　　3.乙醇增加FAK磷酸化，且呈劑量、時(shí)間依賴(lài)性(p＜0.05，p＜0.01)，但并不影響FAK總蛋白水平;
　　4.給予4MP可以削弱過(guò)量乙醇引起的FAK磷酸化增高(p＜0.05);給予乙醛增加pFAK Y397(p＜0.01);
　　5.乙醇、乙醛刺激均可激發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞中ROS產(chǎn)生;
　　6.給予外源性H2O2可以激發(fā)FAK磷酸化(p＜0.01);給予NA

17、C可部分降低乙醇、乙醛引起的FAK磷酸化水平(p＜0.05)。
　　小結(jié):過(guò)量乙醇一方面干擾了FAK參與的內(nèi)皮細(xì)胞黏著斑成熟，不能有效“引導(dǎo)”F-actin骨架，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞生存、粘附、遷移功能受損;另一方面增加pFAK水平，且乙醇和（或）其代謝產(chǎn)生的乙醛、氧化應(yīng)激是引起FAK酪氨酸磷酸化的重要因素之一;過(guò)量乙醇并不影響FAK總蛋白水平。
　　第三部分、黏著斑激酶磷酸化在過(guò)量乙醇引起的內(nèi)皮細(xì)胞毒性中的作用
　　目的:本

18、部分實(shí)驗(yàn)將以PI3K/AKT信號(hào)通路著手研究過(guò)量乙醇干預(yù)后FAK磷酸化增高在內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮(nitric oxide，NO)內(nèi)穩(wěn)態(tài)破壞中的作用。
　　方法:
　　1.利用NO特異探針DAF-FM檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞NO產(chǎn)生，并利用eNOS特異抑制劑N-硝基-L-精氨酸甲酯鹽酸鹽（ω-nitro-L-argine methyl ester，L-NAME）、iNOS特異抑制劑L-canavanine和FAK自主磷酸化抑制劑PF5732

19、28(PF228)研究NO來(lái)源;
　　2.在給予HUVEC乙醇刺激前給予PI3K/AKT通路抑制劑wortmannin和PF228預(yù)處理研究eNOS活化的相關(guān)通路;
　　3.用western blot檢測(cè)硝基酪氨酸(nitrotyrosine，NT)產(chǎn)生量。
　　結(jié)果:
　　1.乙醇引起NO明顯增高(p＜0.05);L-NAME或PF228可以減弱乙醇引起的NO增加(p＜0.05)，而L-canavanine作用

20、不明顯;
　　2.給予wortmannin和PF228均可明顯減弱乙醇引起AKT和eNOS磷酸化(p＜0.05);
　　3.200mM乙醇干預(yù)24h后明顯增加內(nèi)皮細(xì)胞NT生成量(p＜0.05)。
　　小結(jié):過(guò)量乙醇刺激引起的FAK磷酸化通過(guò)PI3K/AKT通路促進(jìn)的eNOS活化，產(chǎn)生過(guò)量NO，生成具有細(xì)胞毒性的NT，造成內(nèi)皮細(xì)胞損傷。
　　結(jié)論:
　　過(guò)量乙醇可以引起腦血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，其機(jī)制主要表現(xiàn)在兩個(gè)